外源蛋白酶对肉鸡饲粮体外降解效率的影响

王 雄 唐小懿 陈凤鸣,2 陈清华*

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2.湖南领道农业环保科技有限公司，长沙 410128)

外源蛋白酶具有改善畜禽生长性能、提高饲粮蛋白质消化利用率等功能[1]，但其功能的发挥不仅取决于自身的酶学特性，还与目标动物及基础饲粮组成紧密相关。用动物试验法评定外源蛋白酶有效性复杂、耗时，因此，寻求一种简单、快速的体外法用来评定外源蛋白酶的有效性已成为饲料生产和养殖业的迫切需求。体外法分为外源酶法、内源酶法和仿生消化酶法3种[2]。外源酶法的代表是Boisen等[3]建立的胃蛋白酶-胰液素法，前人研究表明外源酶法能快速评定外源酶有效性，可作为动物试验的预试验，但也存在精确性较差、结果不稳定等缺点[4-6]。内源酶法所用消化酶稳定性差，试验结果可比性差，基本退出体外评定体系[2]。而仿生消化酶法对畜禽消化生理的模拟程度更高，对畜禽饲粮具有很好的生物学效价，可利用仿生法筛选畜禽饲粮的最佳酶谱及酶添加量[7-8]。但利用仿生法评定外源蛋白酶有效性的研究较少。因此，本试验通过单胃动物仿生消化系统建立肉鸡体外模拟消化模型，研究外源蛋白酶对肉鸡饲粮体外降解效率的影响，确定蛋白酶最适添加量，为快速评价蛋白酶的有效性提供方法参考，并为其在肉鸡中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

外源蛋白酶：由山东隆科特酶制剂有限公司提供，实测含11 464 U/g酸性蛋白酶、25 635 U/g中性蛋白酶和21 655 U/g碱性蛋白酶。酶活定义：在特定pH(酸性蛋白酶pH=3.0、中性蛋白酶pH=7.5和碱性蛋白酶pH=10.5)，40 ℃条件下，每分钟水解酪素产生1 μg酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位(U)。

1.2 试验饲粮及试验设计

试验饲粮参照NY/T 33—2004《黄羽肉鸡饲养标准》[9]和NRC(1994)肉鸡营养需要[10]标准配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。试验采用单因素完全随机设计，对照组为肉鸡基础饲粮[分前期(1～21日龄)和后期(22～42日龄)]，试验组分别在肉鸡前期和后期基础饲粮中添加100、200、400和800 mg/kg的外源蛋白酶，试验共10种饲粮样品，每种饲粮样品设5个重复，每个重复1根仿生消化管。饲粮采用四分法取样后，用小型饲料粉碎机粉碎过60目筛，充分混合均匀后-20 ℃储存备用。

1.3 试验方法

本试验使用单胃动物仿生消化系统(SDS-Ⅲ)模拟饲粮在鸡的胃肠道的消化过程。仿生消化操作过程中透析袋的型号和前处理、胃缓冲液和小肠缓冲液的配制和仪器运行参数等参照文献[11]。

操作步骤：称取(2±0.000 2) g饲粮样品置于装有透析袋的仿生消化管中，并加入20 mL已配好的胃液。将仿生消化管固定在已预热的单胃动物仿生消化系统上，连通事先配制的胃、小肠段缓冲液。胃阶段模拟消化过程(41 ℃条件下消化4 h)结束后时，准确地将2 mL小肠液移入单胃动物仿生消化系统的小肠消化液储备室中，继续进行7.5 h的小肠前段消化和7.5 h的小肠后段消化。消化过程结束后，将消化残渣无损转移到已绝干恒重的培养皿中，放在65 ℃烘箱中烘干至无水痕后，105 ℃烘干至恒重。将培养皿中的消化残渣全部刮下，转移到已绝干恒重的玻璃砂芯坩埚中，无水乙醇脱脂(用无水乙醇冲洗残渣3次)后105 ℃烘干至恒重。根据以下公式计算样品脱脂后干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值[12]：

DMD(%)=(M1-M2)/M1×100；GED(%)=(GE1-GE2)/GE1×100；EHGE=(GE1-GE2)/(M1×1 000)。

式中：DMD为饲粮体外干物质消化率(%)；GED为饲粮体外总能消化率(%)；EHGE为饲粮体外酶水解物能值(MJ/kg)；M1为上样饲粮干物质重量(g)；M2为未消化残渣干物质重量(g)；GE1为上样饲粮总能(MJ)；GE2为未消化残渣总能(MJ)。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kilogram of diets：TiO25 000 mg，VA 12 000 IU，VD32 500 IU，VE 20 IU，VK33.2 mg，VB13.0 mg，VB210.0 mg，VB66.0 mg，生物素 biotin 0.1 mg，泛酸 pantothenic acid 20.0 mg，叶酸 folic acid 1.25 mg，Fe 90 mg，Zn 80 mg，Mn 1 000 mg，Cu 10 mg，I 0.5 mg，Se 0.15 mg。
2)营养水平均为计算值。Nutrient levels were all calculated values.

1.4 数据统计分析

试验数据采用SPSS 19.0软件one-way ANOVA程序进行单因素方差分析，用Duncan氏法进行多重比较，并对不同蛋白酶添加量的效应进行线性和二次回归分析，结果用平均值±标准差表示，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 外源蛋白酶对肉鸡前期饲粮体外干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值的影响

由表2可知，与对照组相比，200 mg/kg蛋白酶组干物质消化率显著提高(P<0.05)，其他加酶组干物质消化率有提高趋势(P>0.05)，且干物质消化率与蛋白酶的添加量呈二次线性关系(P<0.05)。100、200和400 mg/kg蛋白酶组总能消化率和酶水解物能值均显著高于对照组(P<0.05)，总能消化率、酶水解物能值与蛋白酶的添加量呈二次线性关系(P<0.05)。

表2 外源蛋白酶对肉鸡前期饲粮体外干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值的影响Table 2 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE in vitro of broiler starter diet

同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。
Values in the same row with different letter superscripts differ significantly (P<0.05). The same as below.

2.2 外源蛋白酶对肉鸡后期饲粮体外干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值的影响

由表3可知，与对照组相比，试验组干物质消化率和总能消化率显著提高(P<0.05)，且干物质消化率和总能消化率与蛋白酶的添加量呈二次线性关系(P<0.05)；肉鸡后期基础饲粮添加100、200和400 mg/kg蛋白酶后，胃肠道酶水解物能值显著提高(P<0.05)，且酶水解物能值与蛋白酶的添加量呈二次线性关系(P<0.05)。

表3 外源蛋白酶对肉鸡后期饲粮体外干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值的影响Table 3 Effects of exogenous protease on DMD, GED and EHGE in vitro of broiler finisher diet

3 讨 论

与其他体外法相比，基于单胃动物仿生消化系统的仿生法具有“标准化、仪器化、自动化”等优势，能确保试验结果的准确性和精确性[13-15]。张立兰等[12]研究表明，通过单胃动物仿生消化系统可预判外源蛋白酶的有效性，且饲粮全消化道干物质消化率及酶水解物能值和外源蛋白酶添加量具有较好的线性回归关系。本试验结果表明，外源蛋白酶可提高肉鸡玉米-豆粕型全期基础饲粮体外干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值，且三者与蛋白酶添加量呈二次线性关系。Fru-Nji等[16]研究发现，肉鸡玉米-豆粕型基础饲粮中添加蛋白酶可显著提高能量利用率；Stefanello等[17]分别在肉鸡豆粕型和玉米-豆粕型半纯合饲粮中添加蛋白酶，干物质和能量的回肠末端和全消化道消化率显著提高；Angel等[18]研究表明，在7～22日龄肉鸡饲粮中添加蛋白酶可提高饲粮养分的表观消化率，这都与本试验结果相符。外源蛋白酶可降低饲粮中抗营养因子，提高饲粮水解效率，从而增加其可消化性。如黄明媛[19]发现蛋白酶能快速降解豆粕中抗营养因子，有效提高豆粕消化率；Lahaye等[20]报道蛋白酶能够消除大豆中的胰蛋白酶抑制因子；Yu等[21]采用胃蛋白酶-胰液素体外法研究表明蛋白酶可促进大豆蛋白的降解。外源蛋白酶除了降解饲粮中蛋白质和抗营养因子外，可能也影响着模拟肠消化中内源酶的活性。李慧[22]发现在肉鸡饲粮中添加327 mg/kg蛋白酶，有提高内源酶分泌的趋势，添加2 619 mg/kg蛋白酶使1～21日龄和22～42日龄肉鸡小肠食糜淀粉酶活性分别降低了8.75%和28.14%；周梁[23]发现添加200 mg/kg的蛋白酶使肉仔鸡空肠食糜的胰蛋白酶活性、糜蛋白酶活性均有显著提高；800 mg/kg的蛋白酶添加量能显著降低胰腺的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。本试验中，饲粮体外干物质消化率、总能消化率和酶水解物能值随着蛋白酶添加量的增加呈先升高后降低的变化，有可能是适宜外源蛋白酶添加量能提高内源酶活性，外源蛋白酶添加量过高则抑制了内源酶活性。本试验结果表明，肉鸡前期和后期基础饲粮中添加200 mg/kg外源蛋白酶，饲粮降解效果最好；通过单胃动物仿生消化系统可快速评定蛋白酶有效性，也为蛋白酶在肉鸡饲粮中的应用提供科学依据。

4 结 论

适量外源蛋白酶可显著提高肉鸡基础饲粮体外降解效率；本试验中，200 mg/kg蛋白酶组体外降解效率最高。