同型半胱氨酸水平与炎症因子在稽留流产中的作用及两者的关系

郁金芬 李海燕 赵莹琰 许 洁

南京中医药大学附属张家港医院(215600)

稽留流产是自然流产的一种特殊类型，其B超一般表现为妊娠囊形态不规则，枯萎塌陷或无心管搏动[1]。近年来，随着环境变化及高龄妊娠妇女增多等原因，稽留流产的发生率呈现增高趋势[2]。其病因极其复杂，国内外文献报道涉及了染色体、生殖道感染、畸形、内分泌、免疫失衡、细胞凋亡、氧化应激、母胎界面循环、环境等诸多影响因素[3]。尽管目前人们对稽留流产的研究较多，但具体的病理机制尚未明确。本研究主要探讨Hcy水平与炎症因子在稽留流产中的作用及关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

以2015年12月—2016年8月来本院要求早孕负压吸宫术或因稽留流产行清宫术的妇女为研究对象，纳入标准：妇科检查、B超或子宫输卵管造影等检查排除先天性生殖器官解剖学畸形或肿瘤；内分泌功能正常(包括月经周期正常、甲状腺功能正常、无糖尿病史，无静脉栓塞史，无肝、肾等急慢性疾病)；稽留流产妇女(稽留组)流产前超声证实胚胎停育，且通过流产绒毛组织染色体检测排除因染色体非整倍体异常或片段重复或缺失引起的胎停；人工流产妇女(对照组)无自然流产、死产、死胎、胎盘栓塞等不良孕产史，且本次流产前超声证实胎儿发育与孕周相符。入选妇女均签署知情同意书。

1.2 血浆各指标测定

用全自动生化仪测定空腹胰岛素，化学发光法测孕酮及三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)；葡萄糖氧化酶法测空腹血糖；用循环酶法检测血浆Hcy，用放射免疫法测定血中叶酸浓度。正常人Hcy值是5～15μmol/L；正常人叶酸4.5～34nmol/L。胰岛素抵抗指数(HOME-IR)=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5。

1.3 样本准备及荧光定量PCR(RT-PCR)

流产绒毛组织均取自清宫术，用QIAGEN公司的RNeasy Blood & Tissue试剂盒分批提取绒毛组织基因组 RNA，紫外分光光度计以OD260值确定RNA含量并稀释，使其终浓度为1 μg/μl。混合待逆转录的各组分后，一步法在热循环仪上42℃、60min逆转录成cDNA，完成后按照RT-PCR各反应组分比例混合后进行反应[4]，GAPDH作为管家基因进行内参对照。所有实验均重复3次，且所有目的基因的表达量均为与GAPDH进行归一化后的相对循环阈值。引物见表1。

表1 RT-PCR引物列表

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

稽留组72例，年龄(29.8±3.5)岁，妊娠次数(1.9±0.5)次；对照组133例，年龄(27.5±4.7)岁，妊娠次数(1.4±0.6)次。两组妇女的孕周、体质指数(BMI)、HOME-IR及甲状腺功能指标(TSH、T3、T4)均无统计学差异(P>0.05)。见表2。

2.2 血浆Hcy与叶酸水平

稽留组Hcy水平为(6.2±3.3)μmol/L，叶酸水平为(14.3±5.8)nmol/L；对照组Hcy水平为(4.4±3.6)μmol/L，叶酸水平为(16.7±4.5)nmol/L。稽留组妇女的Hcy水平高于对照组(t=3.61，P=0.001)，而叶酸水平则低于对照组(t=3.21，P=0.002)。

2.3 炎症因子mRNA表达水平

稽留组妇女流产组织中TNF-α、TLR2和TLR4的mRNA表达水平与对照组比较差异均有统计学意义(t=23.33，P<0.001；t=9.19，P<0.001；t=5.29，P=0.001)，分别是对照组妇女的(4.3±0.4)、(2.3±0.5)和(1.9±0.4)倍。

2.4 Hcy水平与炎症因子的相关性

用线性回归分析相关性结果显示，Hcy水平与炎症因子TNF-α、TLR2和TLR4 mRNA表达水平均呈正相关(分别为r=0.86，P=0.007；r=0.78，P=0.036；r=0.75，P=0.024)；与叶酸水平呈负相关(r=-0.74，P=0.031)。

表2 两组妇女临床资料比较

3 讨论

Hcy是甲硫氨酸(Met)的中间代谢产物，而Met是人体必需氨基酸之一。血浆中超过70%的Hcy与白蛋白结合，并以多种形式存在。Hcy代谢过程中有3个关键酶，分别是5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶(MS)和胱硫醚β-合成酶(CBS)[5]。其代谢途径有两条，包括再甲基化和转硫基途径代谢，这两条途径使Hcy水平在体内维持动态平衡，并处于相对安全的低水平(正常人群Hcy水平5～15μmol/L)。然而，当MTHFR、MS和CBS 3种关键代谢酶活性或体内叶酸水平过低时，可导致体内的Hcy蓄积，从而使血浆Hcy水平升高[6]。体内高浓度的Hcy水平具有细胞毒性和胚胎毒性，抑制胚胎发育或造成胚胎停育，导致稽留流产的发生。已有研究报道，参与Hcy代谢途径的各种酶如出现遗传缺陷，则可能引起Hcy浓度升高，严重者可导致高同型半胱氨酸血症[7]。近期有临床研究表明，每日服用400 μg叶酸就可以通过改善血管内皮功能、降低氧化应激、改善大动脉弹性功能而利于血管收缩舒张功能的发挥，即提示叶酸可以显著改善由于血浆Hcy水平过高导致的血管损伤[8]。本研究中，两组无论Hcy平均水平还是叶酸平均水平均在正常范围内，但稽留组Hcy平均水平高于对照组，提示孕早期的胚胎停育与高水平的Hcy有一定关系。此外，稽留组叶酸平均水平低于对照组，提示Hcy 的相对高水平状态可能与叶酸水平较低相关。

绒毛组织是早孕时期母体与胚胎直接接触的部分，常用作稽留流产发生机制的研究对象。妊娠期间，绒毛组织在非特异性免疫反应中起了重要作用[9]。有研究指出，高水平Hcy与炎症因子如TNF-α和IL-1β的表达升高密切相关[10]。TNF-α是一种具有多种生物学活性的多效细胞因子，具有免疫调节、炎症介导等作用，在机体的免疫防护和免疫病理损伤中起着双重作用[11]。妊娠期TNF-α主要由胎盘和脂肪组织合成和分泌，随着孕周的增加胎盘逐渐发育成熟，释放入血的TNF-α量也逐渐增加，孕晚期达到最大分泌量[12]。TNF-α的异常激活将导致免疫平衡破坏从而引发流产。本研究中，稽留组妇女的TNF-α的mRNA表达水平较对照组升高，且与Hcy水平呈正相关，提示高Hcy水平可能通过激活核转录因子来启动细胞粘附分子和趋化因子的表达，从而促炎因子的表达引起慢性炎症反应。

TLRs 在妊娠早期绒毛组织中的表达已经被发现，而在妊娠晚期胎盘中表达量更高。当妊娠母体发生感染时，机体能够快速的发生免疫应答反应。TLRs是一种跨膜蛋白受体，主要参与非特异性免疫反应，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。它可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子，激活NFkB转录因子，从而诱导多种炎症因子的表达，在慢性炎症和代谢紊乱的发生发展中发挥作用[13]。目前，已经发现的人TLRs家族成员有11个，其中了解比较清楚的有TLR2、TLR4、TLR5和TLR9，人类胎盘和绒毛膜组织上主要表达和发挥作用的是TLR2和TLR4[14]。本研究结果显示，流产绒毛组织中的TRL2和TLR4的mRNA表达水平在稽留组显著高于对照组，且与Hcy水平呈正相关。

综上，本研究发现稽留流产妇女绒毛组织的Hcy水平升高，并可引起TNF-α、TRL2和TLR4的mRNA表达水平的升高，表明稽留流产可能与叶酸水平降低、Hcy水平升高引起炎症因子释放的免疫反应相关，该结论为稽留流产的机制和治疗提供了新的参考和思路。