法夫酵母虾青素高效液相色谱分析前处理方法改进研究

王 春， 杜希萍,2,3， 姜泽东,2,3， 黄高凌*,2,3， 肖安风,2,3， 倪 辉,2,3

(1.集美大学食品与生物工程学院，福建厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021；3.厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建厦门 361021)

虾青素(Astaxanthin)是一种酮式类胡萝卜素，分子式为C40H52O4，呈红褐色，不溶于水，易溶于二氯甲烷、氯仿与丙酮等有机溶剂，它具有良好的抗氧化、清除自由基、猝灭单线态氧的功能[1]。法夫酵母(Phaffiarhodozyma)是一种极具产业化前景的天然虾青素资源，其具有丰富的虾青素合成代谢途径[2]，且容易进行规模化发酵生产[3]。目前，高效液相色谱法(HPLC)是广泛应用的测定虾青素的分析方法。但在HPLC法分析的样品前处理过程中,常需要对待测溶液进行微滤，以保护色谱系统并延长色谱柱使用寿命，消除由于颗粒摩擦引起的压力波动和无规律的基线波动，提高仪器检测的准确度。滤膜对分析物可能具有吸附作用，从而影响分析的灵敏性和准确性。比如，Hu等[4]用HPLC法分析茶叶中儿茶素类和生物碱时，发现滤液用NL66、PES、MCE和PTFE滤膜过滤后，儿茶素含量存在较大差异；吴彩娟发现聚酰胺(Nylon)对游离虾青素具有物理吸附作用[5]。因此，研究微孔滤膜对目标分析物的吸附作用，并减少膜过滤的影响十分重要。

最近，本课题组发现法夫酵母虾青素甲醇提取液经微孔过滤后，滤膜上吸附了一层虾青素，这可能会影响虾青素分析测定的灵敏度和准确性。虽然微孔滤膜过滤对虾青素具有吸附作用已受到关注，但尚未见滤膜吸附影响虾青素液相色谱检测结果的报道。本文通过研究证实了微孔滤膜对虾青素的吸附作用，同时发现用添加二甲基亚砜(DMSO)的甲醇溶液作为配制虾青素的溶剂可以减少滤膜对虾青素的吸附量，为提高虾青素HPLC法分析的灵敏度和准确性提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂与材料

LC-200高效液相色谱仪(岛津(中国)公司)，配PDA检测器、7125型手动式进样器、20 μL进样环； 5810 R型离心机(艾本德(中国)有限公司)；KQ5200DE数控超声波清洗仪(河北润联科技开发有限公司)；LaboStar1-DI系列超纯水机(西门子股份公司)；BS223S分析天平(赛多利斯科学仪器厂)；Epoch2T全自动定量绘图酶标仪(美国，伯腾仪器有限公司)。

虾青素标准品以及色谱纯甲醇购自Sigma Aldrich；分析纯甲醇及二甲亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限责任公司。

法夫酵母PhaffiarhodozymaJMU-MVP14干酵母菌体由厦门汇盛生物有限公司提供。

1.2 色谱条件

色谱柱：安捷伦 ZORBAX SB-C18柱(100×2.1 mm i.d.,3.5 μm)；流动相为甲醇和超纯水；梯度洗脱程序：0～5 min，甲醇-水(9∶1，V/V)；10～15 min，甲醇；20～45 min，甲醇-水(9∶1，V/V);流速：0.2 mL/min；检测波长：474 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。

2 结果与讨论

2.1 膜材料及膜孔径对虾青素分析的影响

采用0.22 μm PES滤膜与0.22 μm Nylon滤膜，过滤1 mL 20 μg/mL虾青素甲醇标准溶液，观察滤膜颜色变化,测定过滤前后的吸光度变化,结果如图1A所示，虾青素甲醇溶液用Nylon膜过滤，滤膜上吸附了一层褐色物质(图1A中黑色圈内)，而未过滤的滤膜及只过滤甲醇的滤膜颜色洁白。此外，分别使用孔径为0.22、0.45 μm Nylon膜过滤1 mL 40 μg/mL虾青素，对比滤液液相分析的峰面积，结果发现不论是使用Nylon还是用PES膜过滤后，虾青素溶液的吸光度值都显著降低(图1B)。这些结果说明微孔膜过滤对甲醇溶液中虾青素具有显著的吸附作用。

图1 虾青素溶液过滤前后滤膜颜色(A)及滤液吸光值变化(B)Fig.1 The colors of filters(A) and absorbance of astaxanthin solution(B) before and after filtration

采用SPSS进行显著性分析，结果表明Nylon膜和PES膜过滤后虾青素溶液的吸光度值(图1B)以及液相色谱分析峰面积(图2A)之间没有显著差异。该结果说明滤膜材料对虾青素吸附作用的影响不显著。相关研究表明，PES对有机溶剂的耐受能力不如Nylon膜强[6]，因此选用Nylon膜进行后续实验研究。如图2B所示，0.45 μm和0.22 μm孔径Nylon膜过滤后，虾青素峰面积没有显著差异，说明微孔膜孔径对虾青素吸附的影响不显著。由于0.22 μm膜截留的微粒更小，对色谱柱及仪器的保护作用更强，因此，选用0.22 μm的Nylon膜进行后续实验。

图2 过滤膜的材料种类(A)及孔径(B)对虾青素分析的影响Fig.2 The effects of filter material(A) and cut-off size(B) on the analysis of astaxanthin

图3 DMSO含量对虾青素溶液过滤的影响Fig.3 The effect of DMSO content on the filtration of astaxanthin solution(inset:The peak area of the samples with different content DMSO)Note:The different nomal letters indicate significant difference among treat ments at 0.05 level(n=3)

2.2 二甲基亚砜含量对膜吸附虾青素的影响

在虾青素分析测定过程中，常使用二甲基亚砜对细胞进行破壁处理，因此虾青素提取液中常含有一定量的二甲基亚砜，因此向溶剂体系中加入不同量的二甲基亚砜达到改善过滤膜对虾青素的吸附。分别用含有0、2.5%、5%、7.5%、10%和12% 二甲基亚砜的甲醇溶解并定容到25 mL，制得浓度为40 μg/mL的虾青素溶液，用0.22 μm的Nylon膜过滤，进行HPLC法分析，比较峰面积的变化情况。如图3所示，在甲醇溶液中添加二甲基亚砜可以显著提高过滤液的虾青素峰面积，这表明二甲基亚砜可显著减少Nylon膜对虾青素的吸附作用。当甲醇中二甲基亚砜含量为7.5%时，虾青素峰面积最大，说明此时Nylon膜对虾青素的吸附量最小。因此，在后续实验中，确定虾青素溶液中二甲基亚砜浓度为7.5%。

2.3 添加二甲基亚砜时虾青素的标准曲线

用甲醇及含7.5%二甲基亚砜的甲醇溶液分别配制虾青素标准溶液，以色谱峰面积(Y)对溶液质量浓度(X，μg/mL)进行线性回归。结果表明，甲醇配制虾青素标准溶液得到的回归方程为：Y=117 223X+24 060，相关系数R2=0.9994;用含7.5%二甲基亚砜的甲醇配制标准溶液的回归方程为：Y=86 1648X+1 992.5，R2=0.9995。二者相比，加入7.5%二甲基亚砜的甲醇配制虾青素溶液所得的标准曲线斜率增大了7倍多，而截距降低了10倍以上。标准曲线的斜率是表征HPLC法灵敏性的重要指标，本研究用添加7.5%二甲基亚砜的甲醇配制虾青素溶液，所得标准曲线斜率明显高于用甲醇配制虾青素溶液的对应值，说明在甲醇中加入7.5%的二甲基亚砜可显著提高虾青素测定的灵敏度。在此情况下，计算方法的检测限(S/N=3)为2.81 ng/mL，定量限(S/N=10)为14.78 ng/mL。

根据国家食品药品监督管理总局药品审评中心《含量测定分析方法验证的可接受标准简介》[7]判定方法验证数据的可靠性，其中提到线性相关系数(R2)不得小于0.998，Y轴截距应在100%响应值的2.0%。添加7.5%二甲基亚砜的甲醇配制虾青素溶液所得标准曲线的Y轴截距为100%响应值的0.23%，仅用甲醇配制虾青素溶液的Y轴截距为100%响应值的20.5%，超出了2.0%的可靠性分析。由此可见，用添加7.5%二甲基亚砜的甲醇配制虾青素溶液，可以提高虾青素分析的可靠性。

2.4 精密度与回收率

在浓度为3.03 μg/mL的法夫酵母虾青素提取液中，分别添加低、中、高浓度(2.2、4.4和11.0 μ/mL)虾青素标准品，进行加标回收率试验，每个浓度进行6次平行实验，计算加标回收率，如表1所示虾青素的加标回收率在95.11%～100.76%之间。美国食品和药检局(FDA)规定，回收率在80%～120%之间、相对标准偏差在±10%之间，可认为该方法可接受[8]。根据该标准判断，本方法的加标回收率符合FDA分析检测的标准要求。姜淼等[9]用HPLC法分析虾壳中虾青素，测定得到加标回收率为80.41%～109.21%。孙伟红等[10]认为加标回收率是评价分析方法准确度的指标，本研究虾青素的加标回收率范围比相关文献报道的数值更接近100%，说明本方法准确度更高。

表1 虾青素提取样品加标回收率(n=6)

表2 日内精密度与日间精密度

准备3个浓度标准样品(4.5、9.5、14.0 μg/mL)，同1 d内连续进样6次，测定6次检测值的相对标准偏差(日内精密度)；此外，连续3 d进样检测值，计算检测值的相对标准偏差(日间精密度)。如表2所示，低浓度、中浓度和高浓度样品的日内精密度范围为0.13%～1.45%，日间精密度范围为1.14%～1.67%。根据文献报道[7]，供试液含量的相对标准偏差不大于2.0%时可认为其精密度良好。以此标准判断，本研究建立的方法精密度符合分析检测的要求。王松等[11]在分析南极磷虾虾青素时的日内精密度为1.0%～3.4%，日间精密度为1.3%～4.3%。精密度是评价分析方法重复性的重要指标，本实验方法的精密度都小于2.0%，比相关文献报道的精密度更好，说明本研究方法重复性更好。

2.5 法夫酵母虾青素的提取与分析应用

图4 DMSO菌体质量体积倍数对虾青素提取分析的影响Fig.4 The effect of the ratio of DMSO volume to yeast mass on astaxanthin extraction and analysisNote:The different normal letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level(n=3).

取0.30 g法夫酵母干粉，置于50 mL离心管中，加入菌体质量体积倍数为1.5、2、3、4、5和6的二甲基亚砜，45 ℃ 水浴10 min，加入甲醇使二甲基亚砜浓度达到7.5%，以37 680 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm 的Nylon 膜过滤后进行HPLC法分析。如图4所示，随着二甲基亚砜与菌体质量比值的不断增大，提取分析得到虾青素含量值越大；当二甲基亚砜与法夫酵母菌体比例为4时，提取分析出的虾青素含量最大，达到1667.56 μg/g(干酵母)。应国青等[12]报道了甲醇浸提、旋蒸浓缩、四氯化碳溶解、HPLC法分析的虾青素分析流程；谢红等[13]使用石英砂破壁丙酮涡流振荡提取、石油醚萃取、旋蒸浓缩、溶解后进行HPLC法分析的流程；肖冬光等[14]报道了鲜酵母酸热处理、冰水冷却、离心收集菌体、丙酮振荡提取、取上清液进行分析测定的流程。相比其他虾青素提取分析流程，本研究用7.5%的二甲基亚砜为溶剂配制虾青素提取液进行分析测定，不需要进行浓缩及溶剂转换，只需要对菌体进行二甲基亚砜处理、甲醇浸提、离心、微孔过滤后进行HPLC法分析。

3 结论

本文研究了膜材料、膜孔径、溶剂中二甲基亚砜比例对虾青素吸附的影响，改良法夫酵母虾青素HPLC法分析的样品前处理方法。结果表明，微孔滤膜能显著吸附虾青素，膜材料以及滤膜孔径对虾青素吸附没有显著影响；添加二甲基亚砜的甲醇配制虾青素溶液可以减少滤膜对虾青素的吸附量，甲醇中二甲基亚砜含量为7.5%时虾青素吸附量最低。该方法应用于法夫酵母JMU-MVP菌株虾青素提取分析测定，其结果具有更高的灵敏性、可靠性、加标回收率和精密度。