莞香叶及成茶中黄酮类化合物的提取及其对亚硝酸盐的清除率研究*

罗翔宇 刘朝晖** 仇楚惠 吴 丰 倪进东 李林秋，3***

（1 东莞市东莞中学松山湖学校 广东东莞 523808 2 广东医科大学公共卫生学院 广东东莞 523808 3 东莞市环境医学重点实验室 广东东莞 523808）

莞香茶是东莞三大土特产之一，由莞香的新鲜叶子经密封发酵、杀青、烘干、温茶等处理制作而成［1］，茶水颜色为淡黄，口感醇厚，具有利尿解暑调节血糖的功效，为当地人所喜爱。 莞香［Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg］，也称白木香，为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属植物。研究表明，莞香叶富含黄酮类化合物［2］。 黄酮类化合物具有良好的亚硝酸盐清除能力［3］，但是莞香叶制作成莞香茶之后黄酮含量及其清除亚硝酸盐的能力是否受到影响至今尚未见到报道。

本文以莞香茶成茶（包括“刘东晓”“香佬李”和“和加仁”3 个不同品牌）和新鲜的莞香叶为原料，用乙醇提取其中的黄酮类化合物，并比较莞香叶发酵前后的黄酮得率及其对亚硝酸盐的清除效率。 为优化提取条件，研究了液料比、乙醇浓度、提取温度和提取时间对黄酮得率的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 莞香叶采自当地莞香种植基地，由澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室的张志峰博士鉴定，3 个品牌莞香茶均购自当地市场，芦丁标准品（北京索莱宝科技有限公司，纯度≥98%），亚硝酸钠标准品（由天津市津科精细化工研究所提供，纯度98%），九水合硝酸铝晶体 （上海麦克林生化科技有限公司），氢氧化钠，无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂），对氨基苯磺酸（天津市福晨化学试剂厂），盐酸萘乙二胺（成都金山化学试剂有限公司）。 除标准品外，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备 超声波清洗机（购自歌能公司），UV-1800 型紫外可见分光光度计（购自美谱达仪器公司），中药材粉碎机（伊贝诺公司，JB-05），不锈钢筛子（晨兴，60 目）。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理 将莞香茶和新鲜茶叶清洗干净，置烘箱于40 ℃烘干，然后用粉碎机粉碎，过60 目筛，倒入密封袋于干燥器中存放。

1.3.2 测定黄酮类化合物的含量 黄酮类化合物含量的测定在硝酸铝显色法的基础上进行改进［4］，具体方法为：用移液器移取0.25 mL 提取液于10 mL 具塞比色管中，用蒸馏水定容至5.0 mL。 加入0.5 mL 5%的亚硝酸钠溶液，摇匀静置6 min，再加入0.5 mL 的10 %硝酸铝溶液，混匀静置6 min，最后加入4 mL 的1 moL/L 氢氧化钠溶液，摇匀后静置15 min。 同时设置空白对照，移取蒸馏水5 mL，其他试剂同上。 最后以空白对照调为0，于510 nm 波长下测量样品液吸光度。

1.3.3 莞香叶黄酮类化合物得率的测定

1）芦丁标准方程的建立。 先用60 %的乙醇溶液配制0.2 mg/mL 的芦丁标准溶液。 再用移液器分别移取以上的标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于具塞比色管中，用蒸馏水定容至5.0 mL，然后按1.3.2 方法操作。 以芦丁质量浓度（mg/mL）为自变量，吸光度为因变量，绘制芦丁标准曲线，得到如下标准方程：y=11.667x-0.01419（R2=0.9990），线性检测范围为0.02～0.10 mg/mL。

2）黄酮类化合物得率计算公式。 测定提取得到的黄酮溶液的吸光度，按以下公式进行计算：

式中，A 为样品液吸光度，K 为提取液液料比，40 为1.3.2 操作中的稀释倍数。

1.3.4 莞香茶叶黄酮类化合物的提取 称取样品茶粉末1 g，加入20 mL 的60%乙醇［液料比为20∶1（mL∶g）］，于60 ℃超声3.5 h，静置后取上清液，用0.45 μm 滤膜过滤，滤液按1.3.3.2）测定吸光度和计算得率。

1.3.5 黄酮提取液对亚硝硝酸盐的清除能力

1）亚硝酸盐清除率的测定。 亚硝酸盐清除率的研究采用的是李佩艳等［5］的方法并稍做改进。 用移液器移取2 份1 mL 亚硝酸钠溶液置于10 mL具塞比色管中，其中一份加入0.25 mL 莞香茶提取液，另一份作空白对照。 分别往比色管中加入pH=3 的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液1 mL，37℃水浴30 min 后取出。 同时以蒸馏水代替亚硝酸钠溶液作为本底色参比液。 然后分别向3 份试样中加入1 mL 的0.4%对氨基苯磺酸，摇匀、静置3 min，然后再分别加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液0.5 mL，蒸馏水定容至10 mL，静置15 min，于波长545 nm处测吸光度。

2）不同品牌莞香茶黄酮的亚硝酸盐清除效率测定。 分别称取3 种不同品牌的莞香茶各1 g，按1.3.4 方法提取黄酮类化合物，再测定其吸光度，最后按下式计算清除效率［6］：

式中，M0为空白对照的吸光度，MX为提取液的吸光度，M本为本底色参比液的吸光度。

2 结果与分析

本实验以“香佬李”为检测对象，优化莞香茶黄酮的提取工艺。

2.1 乙醇浓度对黄酮类化合物得率的影响考察了乙醇浓度在40%～80%范围内对黄酮得率的影响，结果如图1 所示。 当乙醇浓度为40%时，黄酮得率为1.89%。随着乙醇浓度的增大，得率逐渐增加，并于60%处达到峰值（2.68%）。 但是，当浓度继续增大时，黄酮得率逐渐减小。导致该趋势的原因可能是黄酮类化合物易溶于乙醇等有机溶剂［7］，所以，乙醇浓度增大有利于莞香茶中黄酮的溶出。但是乙醇浓度过大，其他有机化合物的溶出也随之增加，与黄酮类化合物的溶出产生竞争关系，导致黄酮类化合物占比下降。

图1 乙醇浓度对得率的影响

2.2 提取时间对黄酮类化合物得率的影响 考察了提取时间在0.5～4.0 h 范围内对黄酮得率的影响，结果如图2 所示。 当提取时间为0.5 h 时，得率为1.69%，随着提取时间的增加，黄酮得率逐渐增加并在3.5 h 达到峰值（2.68%）。当提取时间继续增加时，得率也随之降低。出现上述现象的原因可能是：提取时间小于3.5 h 时，黄酮类化合物的溶出不充分；提取时间大于3.5 h 时，提取时间过长，一些热稳定性较差的黄酮类物质受热分解，从而导致得率下降。

图2 提取时间对得率的影响

2.3 提取温度对黄酮类化合物得率的影响 在40～80℃范围内，温度对黄酮得率影响如图3 所示。 当温度为40℃时，得率为1.84%。 随着温度的升高，得率逐渐升高，在60℃达到最大值2.68%后，得率又随着温度的升高而下降。 出现上述现象的原因也许是当提取温度小于60℃时，茶叶结构的破坏程度随温度升高而增大，黄酮类化合物的溶出量增大；提取温度高于60℃时，黄酮类化合物中热稳定性较差的物质的分解导致得率的下降。

图3 温度对得率的影响

2.4 液料比对黄酮类化合物得率的影响 考察了液料比在10∶1 至30∶1（mL∶g）范围内对黄酮得率的影响，结果如图4 所示。 当液料比为10∶1 时，黄酮得率为2.39%。 在液料比20∶1 之前，得率随液料比升高而升高，在20∶1 时达到峰值（2.68%）。在20∶1 之后，得率随液料比升高而降低。 出现该结果的原因可能是液料比小于20∶1 时，溶剂体积较小，黄酮类化合物尚未溶解完全；当液料比达到20∶1 时，黄酮类化合物的溶解基本达到完全，当液料比大于20∶1（mL∶g）时，黄酮类化合物的浓度将降低，因此，20∶1（mL∶g）为最优液料比。

图4 液料比对得率的影响

综上所述，莞香茶黄酮的最佳提取条件为：提取温度60℃，提取时间3.5 h，乙醇浓度60%，液料比20∶1（mL∶g），在最佳条件下提取黄酮类化合物的得率为2.68%。

2.5 莞香茶与新鲜莞香叶中黄酮类化合物对亚硝酸盐清除能力的比较 比较了新鲜莞香叶与3 种品牌莞香茶黄酮类化合物的得率及其对亚硝酸盐的清除能力，结果如表1 所示。 在最优条件下，新鲜莞香叶中黄酮的得率为2.44%。 3 个品牌莞香成茶中，“和加仁”和“香佬李”的黄酮得率较新鲜莞香叶分别上升9.01%和9.84%，而“刘东晓”不升反降，降低3.69%。 这可能与不同品牌莞香茶的具体制作工艺不同有关。 对于清除亚硝酸盐的能力来说，新鲜莞香叶的黄酮提取物的效率最高，为77.88%，而3 种莞香茶提取物的清除亚硝酸的能力均有所下降：“和加仁”下降6%，“香佬李”下降8.76%，“刘东晓”下降13%。 总的来说，莞香茶中黄酮得率与新鲜莞香叶相比有上升也有下降，但下降幅度均不超过10%；3 个品牌中黄酮对亚硝酸盐的清除能力也均有下降，但下降幅度不超过13%。

表1 不同品牌莞香茶黄酮得率及其对亚硝酸盐清除效率的比较（n=3）

3 结论

本文通过优化莞香茶中黄酮类化合物的提取条件，建立了莞香茶中黄酮类化合物的提取工艺并在最优条件下提取了新鲜莞香叶和3 种品牌莞香茶中的黄酮类化合物，结果表明，莞香茶的制作工艺对黄酮类化合物及其亚硝酸盐清除率均无明显影响。 莞香叶发酵成为莞香茶后，口感醇厚、香味浓郁、性质温和、对胃部刺激减小。 与此同时，又保留了新鲜茶叶中的高黄酮含量的性质及其优良的清除亚硝酸盐的能力。因此，莞香叶制成莞香茶后既迎合了消费者对口味的追求又保证了其天然的功效，具有一定的推广价值和市场前景。