芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因的克隆及序列分析

李丽　孙健　易萍　饶川艳　李昌宝　何雪梅　零东宁　肖占仕　盛金凤　唐雅园　李杰民　郑凤锦

摘要：【目的】克隆芒果乙烯受體ETR1和ERS1基因（MiETR1和MiERS1），并进行生物信息学分析，为研究乙烯受体在芒果成熟和衰老过程中的调控机制提供理论参考。【方法】以芒果为材料，应用RACE技术扩增MiETR1和MiERS1基因的cDNA序列，并应用生物信息学方法对其编码的氨基酸序列进行预测分析。【结果】克隆获得的MiETR1基因cDNA序列全长2570 bp，开放阅读框（ORF）2220 bp，编码739个氨基酸；MiERS1基因的cDNA序列全长2171 bp，ORF 1890 bp，编码629个氨基酸；GenBank登录号分别为KY002681和KY002682。MiETR1和MiERS1蛋白均为含跨膜结构的非分泌型疏水蛋白，属于乙烯受体ETR1家族成员，以Ser为主、Thr为辅的磷酸化修饰调控乙烯信号转导，均含有3个典型的模块，即GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域，MiERS1蛋白较MiETR1缺少REC结构域。不同物种ETR1和ERS1蛋白的氨基酸序列具有高度保守性，MiETR1和MiERS1均与甜橙（Citrus sinensis）和克莱门柚（Citrus clementina）的ETR1和ERS1蛋白亲缘关系较近，但二者分别聚在两个不同的分支上，表明两个蛋白存在一定的遗传分化。【结论】乙烯受体基因在芒果成熟和衰老过程中发挥调控作用。

关键词： 芒果；乙烯受体；基因克隆；序列分析

中图分类号： S667.703.6 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1053-08

Abstract：【Objective】Ethylene receptor ETR1 and ERS1 genes（MiETR1 and MiERS1） from mango（Mangnifera indica L.） were cloned，and bioinformatics analysis was conducted in order to provide theoretical reference for further study of functional mechanism of the ethylene receptors in mango ripening and senescencing. 【Method】Using mango fruit as material，full-length cDNA sequences of MiETR1 and MiERS1 by RACE technology was amplified，and the encoded amino acid sequences were predicted by bioinformatics method. 【Result】The full-length cDNA sequence of cloned gene MiETR1 was 2570 bp， an open reading frame（ORF） of 2220 bp，encoding 739 amino acids. The full-length cDNA sequence of cloned gene MiERS1 was 2171 bp，and it was consisted of an ORF of 1890 bp，encoding 629 amino acids. The GenBank accession numbers for the two were KY002681 and KY002682. Bioinformatic analysis showed that the MiETR1 and MiERS1 proteins were non secreted hydrophobic protein with transmembrane domain， belonging to the ETR1 family member of ethylene receptor with Ser-based， Thr-assisted phosphorylation-modulatory. MiETR1 and MiERS1 proteins contained three typical modules， namely GAF domain， HisKA domain and HATPase_c domain. MiERS1 protein lacked REC domain compared with MiETR1. The amino acid sequences of ETR1 and ERS1 proteins in different species were highly conserved. MiETR1 and MiERS1 had high homologous with the ETR1 and ERS1 proteins of Citrus sinensis and Citrus clementina. However， the two clustered on two different branches， indicating that there was genetic differentiation between the two proteins at certain extents. 【Conclusion】Ethylene receptor gene plays a regulatory role in mango fruit maturation and senescence.

Key words： mango； ethylene receptor； gene cloning； sequence analysis

0 引言

【研究意义】芒果（Mangnifera indica L.）的肉质嫩滑，营养价值高，享有热带果王的美誉，在世界热带水果中其产量仅次于香蕉，在生产贸易中占有重要地位（孙晓东等，2017）。芒果属于典型的呼吸跃变型果实，夏季采收，采后对乙烯非常敏感（Hare and Singh，2007；Zora et al.，2013），易后熟而变黄、变软，具有不耐贮、易腐烂、代谢旺盛等特点，致使其食用品质大幅度降低，严重制约芒果产业的快速发展（Kefialewa and Ayalew et al.，2008；Zora et al.，2013）。乙烯受体（Ethylene receptor）是乙烯信号转导途径中信号传递的关键因子，也是乙烯应答的必要蛋白（Jiang and Fu，2000；Lelièvre et al.，2010）。通过調控乙烯受体基因的表达水平可直接影响乙烯信号转导，延缓或中断植物成熟等相关变化，进而控制果实成熟和衰老进程，对芒果品质提高及其产业发展均具有重要意义。【前人研究进展】乙烯受体在植物中由多基因家族编码，根据蛋白结构不同，可分为ETR1家族和ETR2家族，其中ETR1家族又可分为ETR1亚类和ERS1亚类，二者的主要区别在于是否存在REC结构域（刘元风等，2003）。自Hua等（1998）、Sakai等（1998）从模式植物拟南芥中克隆获得乙烯受体基因以来，陆续从香蕉（冯斗等，2004）、柿（Pang et al.，2007）、柑橘（John-Karuppiah and Burns，2010）、甜瓜（郝金凤等，2012；陈宇杰等，2013）、枇杷（李丽秀和赖钟雄，2013）、西瓜（Karakurt et al.，2014）等水果中克隆获得乙烯受体基因，并进行分析鉴定，结果发现其分子结构和表达特性均存在明显差异，在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要调控作用（张弢和董春海，2016）。Yau等（2004）从水稻中克隆获得5个乙烯受体基因，并发现其在水稻不同组织中的表达量不同，表明该基因可能参与调控植物生殖的初期阶段。罗江会等（2015）通过分析乙烯处理对蜡梅花朵中乙烯受体基因（CpETR1、CpETR2等）的影响，证实其表达水平受乙烯调控，且与蜡梅花朵开放和衰老密切相关。田晓岩等（2017）从文心兰中克隆获得乙烯受体基因OnERS1，发现其表达量在切花衰老的第6 d急剧下降，第8 d降至最低值，但在乙烯处理下其表达量缓慢上升，第8 d急剧升高，表明OnERS1基因的特异性表达与花衰老密切相关。【本研究切入点】目前，鲜见有关芒果乙烯受体基因的研究报道。【拟解决的关键问题】利用cDNA末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）技术克隆芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因（MiETRSP1和MiERS1），并对其进行序列分析，以期从分子水平了解乙烯受体在芒果成熟和衰老的调控机制，为延缓果实成熟、贮藏及保鲜提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试芒果品种为台农1号，产地广西百色市，挑选大小均匀、成熟度一致的果实为材料，液氮速冻后立即研磨，于-80 ℃保存备用。植物总RNA提取试剂盒购自江苏康为世纪生物科技有限公司；TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；SMARTer RACE 5'/3' Kit购自美国Clontech公司；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；DNA回收试剂盒和DL2000 DNA Marker购自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 总RNA提取及cDNA合成 参照植物总RNA提取试剂盒说明提取芒果总RNA，置于-80 ℃保存备用。参照TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明合成cDNA第一链，用于后续PCR扩增。

1. 2. 2 引物设计及合成 根据GenBank中已发表的拟南芥、苹果、番茄和龙眼等植物乙烯受体基因ETR1和ERS1序列，设计中间片段的简并引物（表1）。分别利用DNAMAN 6.0和Primer 5.0设计5'RACE和3'RACE引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 3 基因扩增 以cDNA第一链为模板，分别对MiETR1和MiERS1基因的中间片段进行扩增。PCR反应体系50.0 μL：10 μg/L cDNA模板1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 25.0 μL，10 μmol/L上、下游引物（MiETR1-F/MiETR1-R，MiERS1-F/MiERS1-R）各2.0 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃（MiETR1）/55 ℃（MiERS1） 30 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的片段，分别将目的片段和pMD18-T载体连接并转化DH5α感受态细胞，转化产物涂布在含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB固体培养基上，培养12 h后挑取单菌落进行重组子菌液鉴定，将阳性克隆送至天根生化科技（北京）有限公司测序。

参照SMARTer RACE 5'/3' Kit说明进行RACE 扩增以获得MiETR1和MiERS1的5'末端和3'末端。RACE扩增反应体系50.0 μL：cDNA模板2.5 μL，10 μmol/L上、下游引物（表1）各1.0 μL，2×SeqAmp Buffer 25.0 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，共进行25个循环。PCR产物同样经上述的回收、纯化、连接、转化及测序。

1. 2. 4 生物信息分析 利用DNAMAN 5.0分别将PCR扩增获得的中间片段与3'末端和5'末端序列进行序列拼接，以获得MiETR1和MiERS1基因全长，并利用在线软件ExPASy ProtParam预测其编码蛋白的理化特性，利用ProtScale预测蛋白亲水性和疏水性，利用NetPhos 3.1预测蛋白磷酸化位点，利用TMPRED和SignalP 4.0 Serve预测蛋白的跨膜结构和信号肽，利用COILS预测蛋白的卷曲螺旋结构，利用NCBI的CD-Search分析蛋白的保守结构域，利用nnPredict和SWISS-MODEL预测蛋白质的二、三级结构，利用ClustalX 1.83进行不同物种间同源基因的多序列比对分析，结合MEGA 4.0的Neighbor-Joining法构建系统发育进化树，并进行1000次Bootstrap检验。

2 结果与分析

2. 1 MiETR1和MiERS1基因克隆结果

利用RACE技术分别克隆获得MiETR1和MiERS1基因的3'末端和5'末端序列，将其与中间片段进行拼接，结果显示，MiETR1基因的cDNA序列全长2570 bp，包括112 bp 5'非编码区（5'-UTR）、238 bp 3'非编码区（3'-UTR）和2220 bp开放阅读框（ORF），编码739个氨基酸；MiERS1基因的cDNA序列全长2171 bp，包含102 bp 5'-UTR、179 bp 3'-UTR和1890 bp ORF，编码629个氨基酸。

将MiETR1和MiERS1基因序列提交至NCBI数据库中，GenBank登录号为KY002681和KY002682，并将其编码蛋白的氨基酸序列与其他物种的同源蛋白进行BLAST比对分析，结果如图1和图2所示。二者与甜橙（CsETR1和CsERS1）、克莱门柚（CcETR1和CcERS1）、拟南芥（AtETR1和AtERS1）和大豆（GmETR1和GmERS1）的相似性分别为91.22%和78.43%、91.08%和75.11%、82.88%和68.89%、84.48%和75.31，表明MiETR1和MiERS1蛋白与其他物种同源蛋白间的相似性较高。

2. 2 MiETR1和MiERS1蛋白的理化性质预测结果

利用ExPASy ProtParam预测MiETR1和MiERS1蛋白的理化性质，结果显示，MiETR1蛋白分子式C3891H6264N1064O1080S36，总原子数12335，分子量86.3851 kD，理论等电点（pI）9.09，负电荷和正电荷的氨基酸残基总数分别为75和88个，脂肪系数106.84，不稳定系数39.39，亲水性0.065，由此推测该蛋白是一个稳定的疏水蛋白；MiERS1蛋白分子式C3595H5734N992 O1046S29，总原子数11396，分子量80.5188 kD，pI 6.34，负电荷和正电荷的氨基酸残基总数分别为77和71个，脂肪系数103.73，不稳定系数38.96，亲水性0.025，由此推测该蛋白是一个稳定的疏水蛋白。

利用ProtScale预测MiETR1和MiERS1蛋白的亲水性和疏水性，结果显示，二者最大疏水性为 +4.500，最小亲水性为-4.500，且有20处疏水性在 +2.000以上的疏水峰，有14个亲水性值在-2.000以下的亲水峰，其疏水性氨基酸明显多于亲水性氨基酸，故推测二者整体呈疏水性。

2. 3 MiETR1和MiERS1蛋白的磷酸化位点预测结果

利用NetPhos 3.1预测MiETR1和MiERS1蛋白磷酸化位点，结果如图3和图4所示。MiETR1肽链中Ser、Thr和Tyr均有可能发生磷酸化，分值在0.5以上的氨基酸位点有89个，其中，含Ser磷酸化位点48个，Tyr磷酸化位点12个。MiERS1蛋白肽链中Ser、Thr和Tyr均有可能发生磷酸化，分值在0.5以上的氨基酸位点有89个，其中，含Ser磷酸化位点35个，Thr磷酸化位点29个，Tyr磷酸化位点12个。可见，MiETR1和MiERS1蛋白是以Ser为主、Thr为辅的磷酸化修饰调控乙烯信号转导。

2. 4 MiETR1和MiERS1蛋白的跨膜结构预测结果

利用TMPRED预测MiETR1和MiERS1蛋白的信号肽和跨膜结构，结果如图5和图6所示。MiETR1蛋白的N末端有3个跨膜区域，分别位于第22～43、53～73和82～106位氨基酸；MiERS1蛋白的N末端有4处跨膜区域，分别位于第22～43、53～73、82～109和575～593位氨基酸。可见，MiETR1和MiERS1蛋白均是跨膜蛋白。利用SignalP 4.0 Serve预测MiETR1和MiERS1蛋白的信号肽，结果显示二者均不含信号肽，推測其均为非分泌蛋白。

2. 5 MiETR1和MiERS1蛋白的卷曲螺旋预测结果

利用COILS预测MiETR1和MiERS1蛋白的卷曲螺旋结构，结果表明，MiETR1蛋白整条肽链未形成卷曲螺旋结构，而MiERS1蛋白在第150～180和340～380位氨基酸形成卷曲螺旋结构的可能性很大。

2. 6 MiETR1和MiERS1蛋白的保守结构域预测结果

乙烯受体蛋白的结构域从功能上可分为GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域（刘元风等，2003）。利用NCBI的CD-Search预测MiETR1和MiERS1蛋白的保守结构域和功能域，结果如图7所示。二者均含有3个典型的模块，即GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域，与MiETR1蛋白相比，MiERS1蛋白缺少REC结构域，MiETR1和MiERS1蛋白氨基酸序列间具有44.00%的相似度，表明MiETR1和MiERS1是乙烯受体蛋白中的不同成员，具有不同的结构和功能。

2. 7 MiETR1和MiERS1蛋白的二、三級结构预测结果

利用nnPredict预测蛋白质的二级结构，结果显示MiETR1和MiERS1蛋白均含有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲3种结构，其中，α-螺旋分别占24.37%和43.45%、β-转角分别占9.97%和7.52%，无规则卷曲占42.93%和29.94%，即MiETR1蛋白的二级结构以无规则卷曲为主，MiERS1蛋白二级结构以α-螺旋为主。利用SWISS-MODEL预测MiETR1和MiERS1蛋白的三级结构，结果如图8所示。

2. 8 系统发育进化分析结果

如图9所示，MiETR1蛋白的氨基酸序列与甜橙（Citrus sinensis，KDO50509.1）和克莱门柚（Citrus clementina，XP_006442239.1）的ETR1蛋白相似度分别达91.22%和91.08%，表明亲缘关系较近，与大豆（Glycine max，XP 006592983.1）、棉花（Gossypium raimondii，XP 012453894.1）、可可（Thebroma cacao，XP 017980588.1）、杨树（Populus euphratica，XP 011009895.1）等植物ETR1的相似度较低，分别为84.48%、87.72%、87.17%和87.01%。MiERS1蛋白的氨基酸序列与甜橙（C. sinensis，AAC99435.1）、克莱门柚（C. clementina，XP006444412.1）和大豆（G. max，XP 006604726.1）的ERS1蛋白相似度分别为75.11%、75.31%和75.31%，与拟南芥（Arabidopsis thaliana，NP 181626.1）的相似度较低，为68.89%。可见，MiETR1和MiERS1蛋白与其他植物同源蛋白的相似度均在68.89%以上，说明不同物种的乙烯受体蛋白序列较保守；MiETR1和MiERS1蛋白分别聚在两个不同的分支上，表明两个蛋白存在一定的遗传分化，与其基因结构上的差异相对应。

3 讨论

乙烯受体由多基因家族编码，在基因时空表达和蛋白结构方面各具特点，而其编码基因是整个乙烯信号转导途径的最上游元件（王中凤等，2006）。目前已克隆获得不同物种果实的乙烯受体基因，如梨（El-Sharkawy et al.，2003）、番茄（魏绍冲等，2003）、水稻（Yau et al.，2004）、苹果（Tatsuki et al.，2007；Wiersma et al.，2007）、木薯（任梦云等，2014）等，通过生物信息学分析，发现不同基因家族成员在系统发育进化树上所在分支不同，表明乙烯受体蛋白的基因具有多样性，但这些基因编码蛋白均含高度保守的GAF结构域和HisKA结构域，即乙烯受体蛋白在生物学功能上具有专一性。本研究应用RACE技术克隆获得MiETR1和MiERS1（GenBank登录号分别为KY002681和KY002682），通过生物信息学分析，发现MiETR1基因的cDNA序列全长2570 bp，ORF 2220 bp，编码739个氨基酸；MiERS1基因的cDNA序列全长2171 bp，ORF 1890 bp，编码629个氨基酸。二者均为含跨膜结构的非分泌蛋白，其中，MiETR1基因的相关研究结果与李运合等（2015）的研究结果基本一致。此外，本研究通过系统发育进化分析，发现MiETR1和MiERS1蛋白的氨基酸序列与甜橙和克莱门柚的ETR1和ERS1蛋白的相似度较高，且均含有GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域3个典型的模块，表明本研究成功克隆获得目的基因。

本研究克隆的两个乙烯受体基因MiETR1和MiERS1均属于乙烯受体ETR1家族成员中的第一类亚家族成员，其功能在芒果乙烯受体家族中可能占有突出地位，MiERS1蛋白比MiETR1蛋白缺乏一个REC结构域，可能导致二者在植物生理调控中存在不同的功能，如在乙烯信号传导初期，仅ETR1蛋白能结合乙烯，其他受体不直接结合乙烯，而与ETR1蛋白形成受体复合物，表明ETR1蛋白在乙烯受体家族中具有支配地位（王中凤等，2006）。目前，至少从37种植物克隆获得ETR1基因，多以果树和观赏植物为主，表明ETR1蛋白广泛存在于各种植物组织中，其结构和功能较保守，通过调节其基因表达水平而调控果实成熟和衰老进程，是延缓果实后熟软化的一个重要途径（Martinez et al.，2001）。

乙烯受体是乙烯信号转导途径中的关键因子，其家族成员在果实成熟过程中可能具有多种调控模式，且不同果实中乙烯受体基因的调控模式也存在差异。通过基因工程技术调控乙烯受体基因的生物学功能，而降低果实对乙烯的敏感性，是延缓果实成熟衰老进程的有效途径之一，目前已在番茄果实中得到证实（魏绍冲等，2004）。因此，从乙烯受体角度上研究成熟果实中乙烯对果实成熟调控机制对延长果实的贮藏寿命具有重要意义。

4 结论

乙烯受体基因在芒果成熟和衰老过程中发挥调控作用。

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（責任编辑 陈 燕）