固氮细菌DX120E的gfp标记及对不同甘蔗品种的接种效应

顾彩彩　王震　王露蓉　毛莲英　宋奇琦　杨丽涛　邢永秀　李杨瑞

摘要：【目的】研究固氮菌株DX120E在甘蔗幼苗中的侵染定殖及其對不同甘蔗品种生长生理的影响，为进一步分析该固氮菌与甘蔗的相互作用机制提供参考依据。【方法】以3个甘蔗品种ROC22、B8和GT21为试验材料，将DX120E用gfp基因标记后，以浸根法接种甘蔗，观察其在甘蔗中的侵染定殖情况，分别在接菌后60、90和120 d，调查甘蔗的株高、叶绿素含量及鲜重，并测定氮代谢关键酶活性指标。【结果】获得了稳定表达的DX120E-gfp接合子菌株；接种后第7 d ，在3个甘蔗品种的根部和叶片中均检测出nifH基因表达，片段大小约为360 bp。荧光显微镜观察结果表明，接种后第7 d，固氮菌定殖在甘蔗的根毛区、新生侧根处、根断裂伤口处及叶片横切处。盆栽试验结果表明，接种固氮菌DX120E对3个甘蔗品种有明显促生作用，与不接菌对照相比，接菌后120 d，ROC22、B8和GT21的株高分别增加23%、20%和14%，地上部分鲜重分别增加25%、31%和11%，地下部分鲜重分别增加40%、34%和30%。且3个甘蔗品种叶片的谷氨酰胺合成酶和硝酸还原酶活性总体上高于对照。【结论】采用菌液浸根法接种甘蔗，固氮菌DX120E能在甘蔗根部定殖并向地上部分转移定殖。采用该方法处理甘蔗，对甘蔗有明显的促生效应，但不同品种间存在一定差异。

关键词： 甘蔗；固氮细菌；DX120E；促生效应

中图分类号： S566.1； Q939.113 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1075-07

Abstract：【Objective】The infection and colonization of nitrogen-fixing bacteria DX120E in sugarcane seedlings and the effects on the growth and physiology in different sugarcane varieties were studied to provide reference for further ana-lysis of the interaction mechanism between nitrogen-fixing bacteria and sugarcane. 【Method】Sugarcane varieties ROC22，GT21and B8 were used as test materials. After DX120E was labeled with gfp gene， sugarcane was inoculated by root-soaking method， and infection and colonization of DX120E in sugarcane were observed. The plant height， chlorophyll content and fresh weight of sugarcane were investigated at 60， 90 and 120 d after inoculation， and the key enzyme activities of nitrogen metabolism were measured. 【Result】Stably expressed DX120E-gfp zygote strains was obtained. On day 7 after inoculation， nifH gene expression was detected in the roots and leaves of three sugarcane varieties， and the fragment size was approximately 360 bp. The results of fluorescence microscopy showed that on day 7 after inoculation， nitrogen-fixing bacteria was colonized in the root hair zone， the neonatal lateral roots， the root fracture wounds and the cross-sections of the leaves of sugarcane. Pot experiment showed that compared with the control of inoculation with no nitrogen-fixing bacteria， the sugarcane inoculated with nitrogen-fixing bacteria DX120E could effectively promote the growth of the three varieties. And 120 d after inoculation， the plant heights of ROC22， B8 and GT21 respectively increased by 23%， 20% and 14%； the fresh weight of aboveground increased by 25%， 31% and 11% respectively； the fresh weight of underground part increased by 40%，34% and 30% respectively. The activity of glutamine synthetase and nitrate reductase in leaves of the three sugarcane varieties was also higher than that of the control. 【Conclusion】By using the root-soaking method to inoculate sugarcane， the nitrogen-fixing bacteria strain DX120E can colonize the roots and transfer to the leaves of sugarcane. Using this method to treat sugarcane has obvious promoting effects on sugarcane， but there are some differences between different varieties.

Key words： sugarcane； nitrogen-fixing bacteria； DX120E； promoting effects

0 引言

【研究意义】甘蔗是我国第一大糖料作物，也是目前极具发展潜力的生物能源作物（李杨瑞等，2014）。广西是我国甘蔗种植大省（区），蔗糖年产量约占全国总产量的70%，然而甘蔗生产中大量的氮肥施入田间后，通过氨的挥发、硝化—反硝化作用和表面流失等途径导致氮肥利用率降低，同时带来严重的环境污染及病虫害问题。因此，研究和利用甘蔗生物固氮是减少氮肥施用及降低生产成本的有效途径。【前人研究进展】1958年，D?bereiner研究团队首次发现了甘蔗根际中的联合固氮菌并证实禾本科植物存在生物固氮潜力（D?bereiner，1961）。内生固氮菌侵入寄主植物的部位主要包括植物的表皮裂隙、伤口、根毛和主侧根连接处等（James et al.，1994，2001）。已有研究表明，接种促生菌能提高甘蔗的鲜重和植株体内矿质元素含量，株高与产量也随之增加，对甘蔗生长具有促进作用（李海碧，2017）。目前，国内对甘蔗内生固氮菌的研究主要集中在甘蔗根际土壤固氮菌的鉴定及其多样性、固氮菌接种对甘蔗生长的影响及甘蔗与固氮菌的互作关系。Suman等（2005）研究表明，接种醋杆菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）后，甘蔗对氮的吸收和生长速率加快。邢永秀（2006）、Magnani等（2010）用选择性培养基通过平板稀释法从甘蔗体内分离培养出一批内生固氮菌。黄杏等（2009）研究表明，用固氮菌（GGS6、CCT2和QZT2）的混合菌液接种甘蔗，甘蔗的根系活力、碳水化合物及蛋白质含量均得到提高。罗霆等（2010）采用15N同位素稀释法证明甘蔗的固氮含量和固氮百分率在接种固氮菌后得到提高。林丽（2011）从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）根内分离鉴定到固氮菌DX120E（Klebsiella sp.），并证实其具有高固氮酶活性。魏春燕等（2014）研究表明，甘蔗基因型对甘蔗与固氮菌间的联合互作有影响。Castanheira等（2017）研究认为，接种固氮菌可提高植物的生长和生理特性，如提高叶片光合色素、脂质生物合成和亚麻酸含量。【本研究切入点】当前关于固氮菌在甘蔗中的侵染定殖多采用组培苗进行研究，以浸根法接种甘蔗幼苗的报道较少，且近年来从广西甘蔗中分离并初步筛选出一些固氮能力较强的固氮菌株，其与甘蔗互作的机理尚不明确。【拟解决的关键问题】采用浸根法接种固氮菌DX120E，研究其对不同甘蔗品种的互作效应，旨在为研究该固氮菌和甘蔗的相互作用机制提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试甘蔗品种为B8、ROC22和桂糖2号（GT21）。供体菌大肠杆菌E. coli TG1/pPROBE-pTetr-OT携带有绿色荧光蛋白标记基因gfp和Smr标记基因，助细菌为DH5α/pRK2013，均由广西农业科学院甘蔗研究所提供。DX120E菌种由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室分离并保存。试验中用到的PCR相关产品购自北京康为世纪生物科技有限公司，抗生素产品购自北京索莱宝科技有限公司，其他化学试剂购自国药集团。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 三亲结合法转化突变株 参考Bartosik等（2002）的方法，将培养过夜的DX120E、供体菌E. coli TG1/pPROBE-pTetr-OT和助细菌DH5α/pRK2013用无抗生素的LB培养液清洗2次；取50 ?L供菌体、100 ?L DX120E和50 ?L助细菌（1∶2∶1）轻柔混合；取100 ?L混合菌液滴在无抗生素的LB培养基上，30 ℃培养8 h；用无抗生素LB培养液悬浮长出的菌体，取100 ?L涂布在含有抗生素的LB培养基上筛选DX120E/pPROBE-pTetr-OT。

1. 2. 2 转化菌株中外源质粒稳定性的检测 抗生素链霉素（Sm）和庆大霉素（Gm）被用作三亲结合试验受体菌的筛选标记，得到抗Sm（100 μg/mL）和Gm（15 μg/mL）的DX120E-gfp菌株。二抗平板上得到的结合子（DX120E-gfp菌株）在无抗生素的LB液体培养基中继代培养30代，再将所得菌液用无菌水稀释107倍，然后用玻璃棒涂布在含有抗生素（Sm100和Gm15）的LB培养基上，获得稳定表达的gfp结合子。

1. 2. 3 鉴定转化子 将得到的结合子涂布在含有抗生素（Sm100和Gm15）的LB培养基上，继代培养并用体式荧光显微镜观察。结合子中gfp基因的扩增：挑取结合子，至其对数期时，取出50 μL液体离心后收集菌体，加入灭菌水50 μL后再离心，取1 μL上清液进行PCR检测。

1. 2. 4 菌悬液制备和接种处理 将获得的稳定表达gfp结合子在LB培养基上划线培养，挑选其中的单菌落于LB液体培养基中培养。在600 nm下吸光值为1.0，离心后用灭菌水稀释至107 CFU/mL，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1. 2. 5 DX120E-gfp处理甘蔗及其在甘蔗中的定殖 待甘蔗幼苗长出4片叶时，选择健壮、无病虫害且长势一致的甘蔗苗，用水清洗干净根部，然后在其根部接入无菌水悬浮的DX120E-gfp，浸泡根部40 min后移栽至塑料桶（桶口直径36.3 cm、内高30.0 cm）中。接种7 d后，取甘蔗幼苗的根系和叶片，无菌水漂洗并灭菌处理后用徒手切片法制作组织切片，将制作好的切片在體式荧光显微镜下观察固氮菌在甘蔗各部位的存在状态。

1. 2. 6 甘蔗不同部位nifH基因的检测 设计DX120E的特异引物，以DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系25.0 μL：Es Taq Mix 12.5 μL，灭菌水9.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，进行30个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物为360 bp左右。

1. 2. 7 甘蔗株高、叶绿素含量和鲜重的测定 用塔尺测量甘蔗株高，即甘蔗根部到+1叶叶环处的长度，测量3株取平均值。用叶绿素含量测定仪SPAD-502测定甘蔗+1叶的叶绿素含量（SPAD值）。将甘蔗植株的地上和地下部分分开并用标签做好标记，称量鲜重并记录数据，每处理3个重复，取平均值。

1. 2. 8 叶片酶活性检测 2017年9～11月采样，采样时间为上午9：00～10：00。每处理随机取3株，取样部位为甘蔗+1叶，去掉叶片梢部用剪刀剪碎后包裹在锡纸中，放进液氮中暂存，样品采完后-80 ℃保存備用。采用比色法测定谷氨酰胺合成酶活性（韦莉萍，2005），采用磺胺比色法测定硝酸还原酶活性（李合生，2000）。

1. 3 统计分析

采用Excel 2010和SPSS 15.0对数据进行整理和统计分析，并以Duncans进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 质粒稳定性检测结果

DX120E-gfp结合子在无抗性的LB培养基中继代培养30代后，97%（291/300）结合子在含有Gm15和Sm100的培养基上可生长，表明pPROBE-pTetr-OT在DX120E中的稳定性较高，可用于下一步试验。

2. 2 gfp标记菌株的PCR检测结果

将DX120E、助细菌和供体菌共培养后，在选择性培养基上长出一些结合子，荧光显微镜下可观察到发绿色荧光的结合子，但助细菌个体、受体菌和供体菌在选择性培养基上均不能生长，结合子可在无氮的选择性培养基上生长。筛选出的稳定表达结合子在体式荧光显微镜下观察发现每个单菌落均能发出绿色荧光（图1）。将单菌落的结合子挑出，置于LB液体培养基中培养，取菌液进行gfp片段的PCR扩增，可获得大小约118 bp的片段（图2）。

2. 3 DX120E在甘蔗根部和叶片中的nifH检测结果

接菌后第7 d，用DX120E的nifH基因片段序列设计特异引物进行PCR检测，结果在甘蔗品种ROC22、GT21和B8的根部和叶片中均能检测出nifH基因，其目的片段大小约360 bp（图3）。除个别样品外，3个甘蔗品种的对照均未检测到nifH基因（图4）。说明在试验用的自然土中有其他固氮微生物进入到甘蔗植株中。

2. 4 DX120E在甘蔗中的定殖情况

接种后第7 d，利用荧光显微镜观察DX120E在甘蔗中的定殖情况，结果发现在甘蔗的根毛（图5-B）、主侧根连接处（图5-C）、根断裂的伤口处（图5-D、5-F）和根尖（图5-E）处有较多的标记菌株DX120E-gfp定殖，同时观察到标记菌株在叶片的横切处定殖（图5-G）。

2. 5 接菌对不同甘蔗品种株高、叶绿素含量及鲜重的影响

2. 5. 1 对株高的影响 由图6可看出，与不接菌对照相比，接菌处理均可显著提高3个甘蔗品种的株高（P<0.05，下同）。接菌后60、90和120 d，ROC22的株高分别较对照增高8%、18%和23%，B8的株高分别较对照增高8%、15%和20%，GT21的株高分别较对照增高6%、12%和14%。

2. 5. 2 对叶绿素含量的影响 由图7可看出，接菌后60、90和120 d，ROC22和B8的叶片SPAD值均较对照显著增加，GT21的SPAD值在接菌后90 d与对照差异不显著（P>0.05，下同），接菌后60和120 d显著高于对照。

2. 5. 3 对地上和地下部分鲜重的影响 由图8和图9可看出，与对照相比，接菌处理均可提高3个甘蔗品种的地上和地下部分鲜重。接菌后60 d，ROC22的地下部分鲜重及B8的地上和地下部分鲜重显著高于对照，其余与对照差异不显著。接菌后90 d，3个甘蔗品种的地上部分鲜重及B8的地下部分鲜重均显著高于对照。接菌后120 d，3个甘蔗品种的地上和地下部分鲜重均显著高于对照，分别较对照提高25%、31%、11%和40%、34%、30%。说明接菌可促进甘蔗生长，且对地上部分生长的促进作用早于地下部分。

2. 6 接菌处理对不同甘蔗品种酶活性的影响

2. 6. 1 对谷氨酰胺合成酶活性的影响 谷氨酰胺合成酶是涉及氨同化的关键酶，其活性在细胞内多种氮代谢酶和部分糖代谢过程发挥重要作用（Bec-ker et al.，2000）。由图10可看出，3个甘蔗品种的谷氨酰胺合成酶活性在接种后60、90和120 d均呈逐渐升高趋势，且总体上高于其对照，其中接菌处理后60和90 d ROC22及处理后90 d B8的谷氨酰胺合成酶活性显著高于对照。

2. 6. 2 对硝酸还原酶活性的影响 如图11所示，接菌后60、90和120 d，ROC22和GT21的硝酸还原酶活性呈先升高后降低的变化趋势，B8的硝酸还原酶活性持续降低。与对照相比，接菌处理均可提高3个甘蔗品种的硝酸还原酶活性，其中接菌后90 d，3个甘蔗品种的硝酸还原酶活性均显著高于对照，分别较对照提高21%、40%和10%。

3 讨论

固氮菌与植物体发生联合作用的决定性因素是固氮菌能否顺利侵入植物体内并在植物体内定殖。利用免疫金标技术发现固氮型内生菌粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）能在水稻的根、茎、叶中定殖，同时该菌在已退化的皮层间隙及木质部中大量存在（Gyaneshwar et al.，2001）。吕泽勋等（2001）利用激光共聚焦扫描电镜观察到根毛区是产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）在水稻中的主要存在部位，同时该菌可定殖在根皮层间隙、通气组织和导管内，在次生根形成处可见较大菌团，在水稻根表其他区域形成的菌团较小。Jha和Kumar（2007）通过组织染色试验研究发现，水稻根系的幼嫩侧根处有可能是产酸克雷伯氏菌进入的主要部位。本研究结果表明，用浸根法接种甘蔗，采用体式荧光显微镜观察及PCR扩增检测，在甘蔗叶片中均成功检测到DX120E菌株的存在。由此可见，浸根接种法能使DX120E进入甘蔗幼苗的根内及地上部分，且该菌能在甘蔗叶片中生存。即浸根接种法能使固氮菌在甘蔗根部定殖并向地上部分转移定殖，为该固氮菌的进一步研发提供了理论依据。

本研究结果表明，接种DX120E能显著提高3个甘蔗品种的株高及地上和地下部分鲜重，与Suman等（2005）、林丽（2011）在甘蔗上的研究结果相似，即甘蔗接种固氮菌后，其对氮素的吸收增加，生长速率加快，同时可提高甘蔗产量并促进其增高，有效促进甘蔗生长。不同甘蔗品种的固氮能力存在差异，甘蔗基因型和环境因子在甘蔗固氮中具有重要作用（Carvalho et al.，2011）。王伦旺等（2010）研究表明，甘蔗品种B8的固氮能力较强。本研究中，接菌处理对ROC22和B8的促生效应比GT21更明显，说明DX120E与ROC22和B8有较好的互作效应。

在氮同化过程中，硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶是氮素同化的关键酶。本研究结果表明，采用浸根法接种甘蔗幼苗，均可在一定程度上提高3个甘蔗品种的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性，但品种间两种酶活性的表现存在差异，ROC22和B8的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性总体上高于GT21，与魏春燕等（2014）用固氮菌接种甘蔗组培苗的研究结果相似，其原因可能是ROC22和B8对固氮菌DX12E的响应能力强于GT21。本研究结果在一定程度上丰富了固氮菌与寄主植物互作的相关研究，为研究有益固氮菌及开发菌肥提供了参考。但本研究是在温室条件下进行，考虑到大田生产中会受到较多外界环境因素的影响，后续工作应侧重开展田间接种试验，进一步开发该菌株的固氮潜能。

4 结论

采用菌液浸根法接种甘蔗，固氮菌DX120E能在甘蔗根部定殖并向地上部分转移定殖。采用该种方法处理甘蔗，对甘蔗有明显的促生效应，但不同品种间存在一定差异。

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（責任编辑 王 晖）