基于SSR荧光标记的MCID快速鉴定13个湖北茶树品种

黄丹娟　马建强　马春雷　王松琳　陈亮　毛迎新　陈勋

摘要：【目的】通過人工绘制品种鉴别图（Manual cultivar identification diagram，MCID）快速区分鉴别湖北茶树品种，为湖北茶树种质资源评价、品种保护及苗木纯度早期鉴定提供技术支持。【方法】以湖北省13个优良茶树品种为材料，利用30对均匀分布于遗传连锁图谱上的SSR荧光引物进行PCR扩增，并用荧光标记毛细管电泳检测扩增产物以筛选出核心引物，利用MCID法构建CID图谱。【结果】30对SSR引物共扩增出145个等位基因，各引物等位基因数为3～9个，平均每对引物为4.83个；共检测到194个基因型，各引物检测出的基因型为3～12个，平均每对引物6.47个；多态性信息量（PIC）为0.29～0.85，平均为0.58。13个茶树品种的Neis遗传距离为0.19～0.44。基于Neis遗传距离，采用Neighbor-Joining（NJ）法可将13个品种分为三大类（Neis遗传距离为0.16），结果表明地理来源相同的品种可能因为具有相似的遗传背景而聚在一起，也可能因为亲本来源不同而存在明显的遗传差异。利用筛选出的3对核心引物（TM547、TM552和TM107）可快速鉴别所有参试品种，通过MCID法构建的CID图谱可直观看出各参试茶树品种鉴定所需要的引物及其对应的基因型。【结论】基于SSR荧光标记的茶树品种MCID鉴定方法具有快速、准确、高效的特点，可用于湖北茶树良种知识产权保护、苗期鉴定及品种区分。

关键词： 茶树；品种鉴定；SSR荧光标记；人工绘制品种鉴别图（MCID）；湖北

中图分类号： S571.103.7 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1045-08

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for the evaluation of Hubei tea germplasm resources， protection of varieties and early identification of the purity of seedlings， manual cultivar identification diagram （MCID） was constructed to quickly distinguish and identify Hubei tea cultivars. 【Method】Thirty pairs of fluorescent SSR markers distributed evenly on the genetic linkage group were used to carried out PCR amplification of thirteen Hubei fine tea cultivars. Fluorescence labeled capillary electrophoresis was used to detect the amplification products and screen the core pri-mers. The cultivar identification diagram（CID） was drawn by MCID method. 【Result】Thirty pairs of SSR primers amplified 145 alleles， ranging from 3 to 9 alleles for each primer， with an average of 4.83. A total of 194 genotypes were detec-ted， and the genotypes detected by each primer were 3 to 12 with an average of 6.47. The range of polymorphism information content（PIC） was 0.29-0.85 with an average of 0.58. Relationship analysis showed that Neis genetic distance of the 13 tea cultivars was 0.19-0.44，and were classified into three groups by Neighbor-Joining（NJ） method based on Neis genetic distance（Neis genetic distance was 0.16）. It indicated that cultivars with the same geographical origin may grouped due to similar genetic backgrounds， or may also show great differences because of their different parental origin. Three pairs of SSR primers， TM547， TM552 and TM107， could rapidly identify all the tested cultivars. According to the CID map constructed by MCID method， the primers needed for the identification of various tea cultivars and their correspon-ding genotypes could be seen directly. 【Conclusion】The MCID method based on fluorescent SSR markers is rapid， accurate and efficient in identification of tea cultivars. It can support the intellectual property protection， seedling appraisal and variety identification of Hubei fine tea cultivars.

Key words： tea； cultivar identification； fluorescent SSR markers； manual cultivar identification diagram（MCID）； Hubei

0 引言

【研究意義】茶树[Camellia sinensis（L.）O. Kuntze]为山茶科山茶属灌木或小乔木，经长期人工和自然选择形成了具有稳定及遗传特性丰富多样的品种资源。湖北省种茶历史悠久，自然条件优越，茶产业已成为宜昌、恩施等山地丘陵地区农民脱贫致富的重要经济产业。目前，湖北省通过国家级审（认、鉴）定的茶树品种有4个，通过省级审（认、鉴）定的茶树品种有14个，其中1个获得植物新品种权。随着湖北省茶树栽培面积的不断扩大，越来越多的省内优良品种应用于茶树生产（陈勋和龚自明，2017）。由于茶树幼苗主要通过无性繁殖获得，在母本枝条扦插、转移、运输和种植过程中极易造成品种混乱。因此，建立湖北省茶树品种快速可靠的鉴定技术对茶树良种知识产权的保护、苗期鉴定、品种区分及其产业发展均具有重要意义。【前人研究进展】传统的形态学品种鉴定法难以鉴别遗传背景相似、亲缘关系较近的植物品种。随着分子标记技术的快速发展，实现了从DNA分子水平上稳定可靠地鉴定植物品种（Mukhopadhyay et al.，2016；张洪源等，2017）。其中，SSR标记具有重复性好、多态性高、数量丰富、呈共显性且广泛分布于基因组等优点，已广泛应用于茶树种质资源遗传评价、遗传图谱构建、品种鉴定及系谱分析（Yao et al.，2012；黄丹娟等，2016；Chang et al.，2017），也是目前分子指纹图谱研究中应用最广泛的遗传标记（贺尔奇等，2016）。刘本英等（2012）利用22个SSR标记对28份云南无性系茶树品种进行了DNA指纹图谱分析，通过不同基因型组合，各品种均获得一个22位数的指纹图谱编号，可将不同品种或无性系完全区分开来。章志芳和马建强（2012）采用EST-SSR标记对14个来自不同省份的茶树品种进行DNA指纹鉴定，将4个核心标记扩增的等位基因谱带组合转化为计算机化的数字编号，绘制成可视化条形码，结果显示各品种均有唯一的指纹图谱，可快速地鉴定参试品种。郭燕等（2016）利用筛选出的4对核心标记，构建了贵州古茶树种质资源的分子指纹图谱，各种质均获得一个18位数的指纹图谱编号，可用于贵州古茶树资源的保护及开发利用研究。Wang等（2016）利用SSR荧光标记电泳检测技术，从33对SSR引物中筛选出6对核心引物，通过人工绘制品种鉴别示意图（MCID）构建了66个来自不同省份的茶树品种鉴别图（CID），从中可直观地看出鉴定各品种所需要的SSR引物及其基因型。陈志辉等（2017）从38对SSR引物中筛选出7对扩增条带少、多态性高的引物，利用其构建了43个福建茶树品种的DNA指纹图谱，可清楚地区分各参试品种。王松琳等（2018）从62对SSR引物中筛选出3对核心引物，利用其构建了16个白化、黄化茶树品种的DNA指纹图谱，结果表明，SSR标记在白化、黄化茶树品种的鉴定方面具有很好的适用性。综上所述，大多数研究均基于SSR引物的扩增谱带转化成DNA指纹图谱而实现对大批量茶树品种进行鉴定，但其缺点是无法直观显示鉴别过程。【本研究切入点】通过MCID可直观显示鉴别过程，找出各参试茶树品种鉴定所需要的引物及其对应的基因型，从而快速鉴定出茶树品种（Wang et al.，2011；许园园等，2016）。但目前鲜见基于SSR荧光标记的MCID快速鉴定湖北茶树品种的研究报道。【拟解决的关键问题】利用30对均匀分布于茶树遗传连锁图谱上的SSR荧光标记引物，对13个湖北茶树优良品种进行PCR扩增，采用荧光标记毛细管电泳检测扩增产物，从中筛选出核心引物，并利用MCID构建CID图谱，以期对13个茶树品种在分子水平上进行快速准确区分，为湖北茶树种质资源评价、品种保护和苗木纯度早期鉴定提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

采集中国农业科学院茶叶研究所国家种质杭州茶树圃茶树健康叶片，液氮冷冻后于-80 ℃保存备用。参试的茶树品种名称及遗传背景见表1。SSR荧光引物由上海祥音生物科技有限公司合成。KAPA2G Fast Multiplex Mix购自北京普凯瑞生物科技有限公司。主要设备仪器：PCR扩增仪（Bio-Rad，美国）、高速大容量冷冻离心机（Beckman，美国）、ND-1000超微量分光光度计（Nanodrop，美国）和ABI 3730XL测序仪（ABI，美国）等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 基因组DNA提取 采用改进的CTAB法（马建强，2013）提取样品基因组DNA，并用l%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，用ND-1000超微量分光光度计检测其浓度。

1. 2. 2 PCR扩增及产物检测 30对SSR荧光引物的相关信息参考Ma等（2014）的文献报道。PCR反应体系25.0 μL：20 ng/μL DNA模板1.0 μL，KAPA2G Fast Multiplex Mix 12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性15 min；94 ℃ 30 s，52～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存备用。毛细管电泳检测参照黄丹娟（2016）的方法。

1. 2. 3 SSR引物多态性分析 采用PowerMarker统计每对引物在13个茶树品种中扩增等位基因数（Na）、基因型数和多态性信息量（PIC）（Liu and Muse，2005）等，并计算各品种间的Neis遗传距离。基于Neis遗传距离进行Neighbor-Joining聚类分析。按照如下标准进一步筛选茶树品种鉴定的SSR核心引物：（1）3≤等位位点数≤5；（2）5≤基因型数≤10；（3）4≤重复碱基个数≤6；（4）PIC≥0.5（王让剑等，2016）。

1. 2. 4 CID图谱绘制 根据SSR扩增图谱，统计某一引物PCR扩增的13个茶树品种条带大小和基因型，将相同扩增谱带的品种归为一组，无此谱带的归为另一组。然后继续添加引物逐步进行鉴别，直至将所有参试品种均清晰地区分开来。最后，根据每步完成的鉴别结果，人工绘制CID图谱，将每一步所用的引物及多态性谱带大小（bp）同时标到CID图谱的相应位置上。

2 结果与分析

2. 1 SSR引物多态性分析结果

由表2可知，30对SSR引物从13个茶树品种中共扩增出145个等位基因，各引物扩增出的等位基因个数为3～9个，平均每对引物为4.83个；共检测到194个基因型，各引物检测出的基因型为3～12个，平均每对引物为6.47个；各引物扩增的PIC为0.29～0.85，平均为0.58，其中多态性较低（PIC<0.25）的引物数量为0对，多态性适中（0.250.50）的引物数量24对（占所有引物总数的80%），尤其以TM400引物的PIC最高，为0.85，扩增得到等位基因9个，基因型个数12个。可见，本研究选用的30对SSR引物多态性丰富，在品种鉴定方面具有较高的应用潜力。以TM551为例，由图1可知，TM551在鄂茶4号、鄂茶5号和鄂茶12号检测出带型分别为132 bp+138 bp、126 bp+132 bp和120 bp+126 bp，电泳结果清晰明确，可直观地将3个品种区分开。

2. 2 亲缘关系分析结果

基于30對SSR多态性引物的扩增结果计算Neis遗传距离，发现13个茶树品种的Neis遗传距离为0.19～0.44（表3）。其中，五峰310与五峰212遗传距离最远，其原因是二者均由五峰当地群体种中选育而来，遗传背景较近；鄂茶1号与鄂茶3号遗传距离最远，其原因可能是鄂茶1号为父母本均为福建省选育的品种，而鄂茶3号是在湖北咸宁当地群体种中选育而来，地理来源较远。

基于Neis遗传距离，对13个茶树品种进Neighbor-Joining聚类分析。从图2可看出，当Neis遗传距离为0.16时，13个茶树品种聚为三大类。第Ⅰ大类包括鄂茶1号、鄂茶12号和鄂茶6号，均由湖北省农业科学院果树茶叶研究所育成，其中鄂茶1号和鄂茶12号聚为同一个亚类，亲缘关系较近，其原因是二者均为福鼎大白茶的后代。第Ⅱ大类包括鄂茶7号、鄂茶3号、鄂茶2号、五峰212、五峰310和金茗1号，主要是从咸宁和五峰当地群体种中选育而成，且地理来源相同的品种聚在同一个亚类。第Ⅲ大类包括鄂茶4号、鄂茶5号、鄂茶9号和鄂茶11号，其中鄂茶4号和鄂茶9号均从宜昌大叶种及其群体中选育而成，与由劲峰种自然杂交后代中选育而成的鄂茶5号聚在同一亚类，从龙井43自然杂交后代中选育而成的鄂茶11号则单独为一个亚类。可见，地理来源相同的品种可能因为具有相似的遗传背景而聚在一起，也可能因为亲本来源不同而存在较大的遗传差异。

2. 3 SSR分子标记鉴定及CID图谱的构建

综合考虑30对引物扩增结果，以杂峰少为基本原则，并结合PIC、等位基因和基因型个数筛选标准，选取3对核心引物TM547、TM552和TM107，用于区分鉴别所有参试品种。根据3对核心引物扩增出的相应谱带信息，构建13个湖北茶树品种的CID图谱，如图3所示。引物TM547扩增的DNA电泳图谱可将13个茶树品种分为五组，第一组包括4个品种，带型为110 bp，表明TM547在这4个品种扩增出的等位基因均为纯合；第二组和第四组均只有一个品种，分别为鄂茶6号和鄂茶2号，带型为98 bp+116 bp和98 bp+104 bp，表明仅使用引物TM547即可将鄂茶6号和鄂茶2号鉴定出；第三组包括2个品种，带型为110 bp+116 bp，第五组包括5个品种，带型为104 bp+110 bp。即利用引物TM547尚无法鉴别出所有参试品种。利用TM552进一步鉴定第一组、第三组和第五组的品种，结果显示，第一组的4个品种可全部鉴定出，带型分别为197 bp、192 bp+202 bp、187 bp+192 bp和187 bp+202 bp；第三组的2个品种也可鉴定出，带型为192 bp+197 bp和187 bp+192 bp；第五组的5个品种中仅五峰310在192 bp处出现特征谱带，可鉴定出，其余4个品种仍无法鉴定。最后，利用引物TM107鉴定第五组的4个品种，结果显示，这4个品种在146 bp+156 bp、141 bp、141 bp+156 bp和156 bp处均出现特征谱带，均可被鉴定出。综上所述，根据构建的CID图谱可直观看出各参试茶树品种鉴定所需要的引物及其对应的基因型，从而快速鉴定出茶树品种。

3 讨论

茶树品种鉴定经历了形态学、细胞学、生物化学和分子标记等发展过程。其中，分子标记鉴定的准确性高，实用性强，尤其是SSR标记技术优势更突出，已广泛应用于各研究领域。长期以来，SSR扩增产物的检测多采用聚丙烯酰氨凝胶电泳，但其存在较大缺陷，如无法显示产物片段的具体大小，在大规模、多批次的数据收集和分析中存在分析通量较低、数据记录工作量过大等问题（郝晨阳等，2005）。为了避免这些缺陷对试验数据造成的误差，本研究采用SSR荧光标记毛细管电泳检测技术，与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，该技术能准确获取扩增产物大小，并实现数据收集和处理自动化，具有高效、准确、灵敏度高等优点（高源等，2012）。目前，该技术已广泛应用于茶树DNA指纹图谱的构建（Tan et al.，2015；陈世军等，2017；Liu et al.，2017），但其检测成本较聚丙烯酰氨凝胶电泳高，尤其是当试验材料数量较多时，需要合成大量的SSR荧光引物，消耗成本更大，因此，可根据实际情况，综合考虑两种检测方法。

采用聚丙烯酰氨凝胶电泳和荧光标记毛细管电泳进行福建茶树品种SSR鉴定，在筛选核心引物时均以等位基因少、条带清晰、间隔明显为原则，淘汰条带多、密集、多态性丰富的引物（王让剑等，2016；陈志辉等，2017）。本研究选用的30对SSR引物均具有丰富的多态性，从构建的CID图谱可看出，用其中3对SSR引物即可区分所有参试材料，效率较高，其原因是本研究采用的荧光标记毛细管电泳法分辨率和灵敏度均较高，可检测出仅相差1～2个碱基的等位基因。如果采用聚丙烯酰氨凝胶电泳，由于其分辨率较低，当引物扩增的等位基因条带较多或参试品种较多时，统计难度较大，易造成误差。为了将构建的CID图谱广泛应用于茶树品种鉴定，本研究采用引物组合法，选择TM547、TM552和TM107共3对核心引物进行CID图谱构建，其原因是这3对引物的基序碱基数分别为6、5和5个，即使利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，也能得到较清晰易读的条带，减少由不同检测方法带来的等位基因大小和数量的判读误差。

目前，越来越多的茶树优良品种或品系来源于少数育种骨干亲本，在性状上表现出较高的相似性，仅使用传统的形态学品种鉴定方法难以进行有效区分（Chen et al.，2007）。此外，构建聚类分析树状图仅显示品种或种质材料间的遗传关系，无法作为品种鉴定的根本依据。构建DNA指纹图谱可准确鉴定大量茶树品种，但无法直观显示鉴定过程。随着品种鉴定方法的发展和完善，MCID较传统鉴定方法有了较大突破，即根据引物扩增结果，具有特异性谱带的品种被单独区分出来，其余品种根据谱带表现进行分组，再通过其他引物区别、分组，直到所有品种被鉴定出（张晓莹等，2012）。Wang等（2016）从33对SSR引物中筛选出6对核心引物，构建了66个茶树品种的CID图谱，该图谱几乎涵盖了福建省所有无性系茶树良种（53个）。本研究通过3对引物构建了13个湖北茶树品种的CID图谱，可直观显示整个鉴别过程，快速找出各参试茶树品种鉴定所需要的引物及其对应的基因型。当需要将新的茶树品种添加到该CID图谱时，可利用本研究所使用的3对引物对新品种进行PCR扩增，根据带型将其标注在CID图谱的相应位置上，以此获得包括更多茶树品种的CID图谱。如果这30对引物无法鉴别新品种，则选用新引物再进行区分。通过上述方法可快速鉴定不明确的品种，有效打击茶苗繁殖市场品种假冒行为，保护育种工作者权益，对实现茶树种质资源管理、苗木早期纯度鉴定及促进茶树品种知识产权的保护均具有重要意义。

4 结论

基于SSR熒光标记的茶树品种MCID鉴定方法具有快速、准确、高效的特点，可用于湖北茶树良种知识产权保护、苗期鉴定及品种区分。

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（責任编辑 陈 燕）