茅尾海无瓣海桑根际土壤细菌多样性及抑菌活性分析

颜栋美　王伟　李蜜　江蕾　易湘茜　高程海

摘要：【目的】研究茅尾海無瓣海桑根际土壤细菌多样性及抑菌活性，挖掘更多潜在新物种和高效活性物质，为进一步研究红树植物根际土壤中细菌的次生代谢产物及研发新型高效生物农药提供参考依据。【方法】从广西钦州茅尾海红树林保护区采集无瓣海桑根际土壤，采用6种分离培养基分离可培养细菌；通过16S rRNA基因序列的系统发育学分析其物种多样性，并采用牛津杯法考察根际细菌对甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性。【结果】从无瓣海桑根际中分离得到可培养细菌97株，通过16S rRNA序列比对排重后，从中获得57株不同细菌，可归为4门5纲9目15科21属，有1株Cellvibrio sp.的潜在新种。其中29株细菌能够抑制甘蔗鞭黑粉菌活性，分别有12、14和14株细菌对甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长、“+”担孢子增殖和“-”担孢子增殖表现出抑制活性，抑菌圈直径范围为7.54～21.81 mm，其中有9株细菌能够抑制2～3种甘蔗鞭黑粉菌的形态。【结论】广西茅尾海红树林保护区中无瓣海桑根际细菌具有较高的物种多样性，蕴藏着潜在新物种资源，且富含抑菌活性菌株。

关键词： 无瓣海桑根际；细菌多样性；甘蔗鞭黑粉菌；抑菌活性；茅尾海红树林

中图分类号： S482.292；Q939.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1095-07

Abstract：【Objective】Diversity and inhibition activity of rhizospheric bacteria which came from Sonneratia apetala in Maowei Sea were studied to find out more potential new species and high-efficiency active materials， and provided re-ference for the further research on secondary metabolites of the rhizospheric bacteria of mangrove plant and the further development of new and efficient biological pesticides. 【Method】The rhizosphere soil of S. apetala were collected from Maowei Sea mangrove reserve in Qinzhou， Guangxi. Six different media were employed to isolate the cultured bacteria. The species diversity was revealed through phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequence， and Oxford cup method was used to investigate the inhibitory activity of the rhizosphere bacteria against Sporisorium scitamineum. 【Result】The 97 strains of culturable bacteria were isolated from the rhizosphere of S. apetala.After comparing the 16S rRNA sequence alignments， 57 different strains of bacteria were obtained， which could be classified into 21 genera， 15 families， 9 orders， 5 classes and 4 phyla. There was also a potential new species of Cellvibrio sp. The 29 strains could inhibit the activity of S. scitamineum. That there were 12， 14 and 14 strains of bacteria exhibited inhibitory activity against mycelium growth， proliferation of “+” spores， and proliferation of “-” spores of S. scitamineum respectively. The diameter of inhibition zone was between 7.54 and 21.81，and 9 strains of which could inhibit the morphology of 2 to 3 species of S. scitamineum. 【Conclusion】The rhizospheric bacteria of S. apetala which come from Maowei Sea mangrove reserve in Qinzhou， Guangxi have high species diversity， contain potential new species resources， and are rich in antibacterial activity strains.

Key words： Sonneratia apetala； bacterial diversity； Sporisorium scitamineum； antibacterial activity；Maowei Sea mangrove

0 引言

【研究意义】近年来，人们对生态环境和食品安全的要求日益提高，生物农药因其高效、低毒、低残留和低制备成本等特点而备受关注，寻找高效、新型的生物农药已成为植保领域研究热点。红树林是陆地向海洋过度的特殊生态系统，兼备陆地和海洋的特质，具有强还原性、强酸性、高水分、高含盐量、营养丰富及氧气缺乏等特征，因而红树植物根际土壤微生物能够产生大量结构新颖、活性突出的次级代谢产物（张偲等，2010），同时包括许多具有显著活性的新菌（孙静等，2014；吴家法等，2017）。因此，研究红树根际土壤细菌，挖掘其潜在的生物活性，成为研发低毒、高效及环境友好型生物农藥的重要途径之一。【前人研究进展】目前，已知红树植物根际土壤微生物能够产生许多结构新颖、活性独特的次级代谢产物，且具有抗肿瘤（缪承杜等，2008）、胞外酶（李倩茹和符夏梨，2009）、抗病毒（李逾，2012）和抗菌（李小群等，2017）等生物活性。梁碧怡等（2012）从红树植物根部土壤中分离出44株具有抑制天然耐药性耻垢分歧杆菌，其中从老鼠簕根际土壤中分离得到的放线菌数量和抗菌活性菌株数量最多；夏丽娟等（2014）从桐花、秋茄、白莲、木榄和老鼠簕等5种红树植物中分离出50株真菌，其中16株真菌对多种球菌有抑菌活性；李小群等（2017）从海芒果及其根际土壤中分离出15株细菌，均对哈维氏弧菌、副溶血弧菌及溶藻弧菌具有抑制活性。【本研究切入点】茅尾海红树林自然保护区为热带海洋性季风气候，海陆交汇使其物质积累丰富，蕴育着丰富的生物多样性，保护区内含有丰富红树植物（常涛等，2015）。但目前有关该保护区内红树植物根际土壤细菌多样性及其对全球危害性病菌——甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）的研究均鲜见报道。【拟解决的关键问题】以广西茅尾海红树无瓣海桑根际为研究对象，通过传统分离技术，分析可培养细菌的多样性及可培养细菌的代谢产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制作用，以期获得更多红树林特有的微生物信息和高活性菌株，为进一步研究红树植物根际土壤中细菌的次生代谢产物及研发新型高效生物农药提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

无瓣海桑根际采集自广西钦州茅尾海红树林保护区（东经108°36′14″、北纬21°44′53″），装于自封袋内带回实验室，置于-20 ℃冰箱保存备用。甘蔗黑粉菌冬孢子于2016年9月初采自广西农业科学院试验田，采集新鲜黑穗病鞭子（冬孢子），轻轻敲打鞭子上的冬孢子，装于封口袋中，4 ℃冰箱保存备用。6种分离培养基（AGG、M5、M6、M7、M9和2216E）。ISP2液体培养基、PDA固体培养基和YEPS液体培养基参照李菲等（2018）的试验配方进行配制。培养基原料、2×Easy Taq Master Mix、DNA Marker、TAE缓冲液、引物（27F和1492R）和GoldView核酸染料均购自北京康为世纪生物科技有限公司，Chelex-100树脂购自美国Bio-Rad公司，其他有机试剂均为国产分析纯。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 根际细菌分离纯化 收集红树无瓣海桑根须表面附着的土壤（距离根须5 mm以内），称取2.0 g土壤样品置于装有20 mL无菌水（内有玻璃珠）的锥形瓶中，手动摇匀；依次制成10-2和10-3稀释度样液，分别取200 μL样液置于6种分离培养基中进行涂布，放入28 ℃培养箱中培养20 d，观察菌落形态特征，挑取菌落进行纯化。纯化后的菌株置于20%（v/v）甘油中，-80 ℃冷冻保藏。

1. 2. 2 PCR扩增和系统发育树分析 采用Chelex-100提取菌株DNA（周双清等，2010），进行PCR扩增（李菲等，2018）。扩增和测序引物为细菌通用引物27F和1492R。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至上海美吉生物医药科技有限公司广州分公司进行测序。其中1个潜在新物种的PCR扩增产物条带切胶回收，连接pUC-T克隆载体后，转化至Top10感受态细胞中，挑取阳性克隆子，采用PCR扩增验证克隆的片段长度并测序。测序结果利用EzTa-xon服务器（http：//www.eztaxon.org/）进行在线比对分析；选取同源性最高菌株作参比对象，运用MEGA 5.0，采用Neighbor-Joining法构建系统发育进化树，系统进化矩阵根据Kimura two parameter模型评估，Boostrap 1000次检测各分支的置信值，评估进化树拓扑结构的稳定性（Tamura et al.，2011）。

1. 2. 3 抑菌活性试验

1. 2. 3. 1 粗提物制备 将对数期生长的菌株接种于ISP2液体培养基中，28 ℃下摇床（180 r/min）培养7 d。用细胞破碎仪处理整个培养液20 min，然后用1∶1（v/v）乙酸乙酯萃取培养液3次，每次20 min以上。浓缩干燥后，用二甲基亚砜（DMSO）配成浓度为10 mg/mL样液，并用0.45 μm有机膜过滤样液，置于 -20 ℃冰箱保存备用。

1. 2. 3. 2 甘蔗鞭黑粉菌担孢子制备 参照李菲等（2018）的方法，用无菌水将甘蔗鞭黑粉菌冬孢子梯度稀释至10-5，在PDA固体培养基上分别用10-3、10-4和10-5 3个稀释度的菌液涂布，28 ℃恒温培养3～5 d，挑选几个表面光滑的菌落和边缘锯齿状的菌落接入1 mL无菌水中，两两组合，在PDA固体培养基上点样验证。若菌落为绒毛状，则为异型（+、-）组合；若菌落为酵母态，则为同型（+、+）或（-、-）组合。并进一步推测出甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子的编号，分别取甘蔗鞭黑粉菌“+”、“-”担孢子接种至YEPS液体培养基中，28 ℃下摇床（180 r/min）培养36 h。用分光光度计检测两种担孢子的浓度，无菌水稀释，使其担孢子数约为1×105 CFU/mL。

1. 2. 3. 3 含菌培养基制备 取10%（v/v）“+”担孢子培养液或10%（v/v）“-”担孢子培养液或5%“+”担孢子与5%“-”担孢子的混合培养液（1.2.3.2中含有1×105 CFU/mL个担孢子数的YEPS培养液）与PDA固体培养基（47～50 ℃）混合均匀，分别倒培养基，待培养基凝固后放牛津杯（已灭菌），并固定在培养基上。

1. 2. 3. 4 抑菌活性测定 采用牛津杯法测定分离获得菌株对甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性。每杯添加100 μL样液，以DMSO为阴性对照，含5 μg/mL啶酰菌胺的DMSO为阳性对照，28 ℃培养2 d，观察并记录抑菌圈。

2 結果与分析

2. 1 无瓣海桑生境根标土壤细菌多样性

采用6种分离培养基从无瓣海桑生境根际中分离得到97株细菌，基于形态特征和16S rRNA基因序列分析排重，获得57株不同细菌，隶属于4门5纲9目15科21属，详见表1。其中，放线菌门包含20株，厚壁菌门包含19株，变形菌门包含15株（7株隶属α-变形菌纲，8株隶属γ-变形菌纲），拟杆菌门包含3株，分别占菌株总数（57株）的35.09%、33.33%、26.32%和5.26%。

基于16S rRNA基因序列比对分结果析（图1）可知，从无瓣海桑根际中分离获得的菌株BGMRC 0127（约1500 bp），与最接近菌种C. gandavensis R-4069T（AJ289162）的相似性为96.67%，基于16S rRNA基因序列鉴定新菌的原则（Keswani and Whitman，2001），确定BGMRC 0127为1株潜在的新菌。在与假单胞菌科中邻近菌株构建的Neighbor-Joining系统发育进化树也发现，其与相似菌株在进化树上聚为一簇，且Maximum-likelihood和Maximum-parsimony法构建的系统发育进化树也获得相同结果。初步确定BGMRC 0127为假单胞菌科中1个潜在的新分类单元。进一步确定菌株BGMRC 0127的分类学地位，还需对该株潜在新菌展开多相分类学研究。

2. 2 根际细菌在各分离培养基的分布情况

采用6种分离培养基从无瓣海桑根际中分离获得97株细菌，不同培养基分离效果见图2。6种分离培养基的分离效果显示：M6（1/10的AGG培养基成分，寡营养）分离得到的物种最丰富，共有10个属；而2216E（酵母提取粉为主要成分，营养较丰富）仅分离获得4个属，且芽孢杆菌属为优势菌属。可见，M6培养基上分离到细菌种类丰富，可作为分离红树林土壤中细菌的首选培养基。

2. 3 抑菌活性筛选结果

对57株细菌发酵液提取物进行抗菌活性筛选，结果（图3和表2）显示，有29株细菌具有抑制甘蔗鞭黑粉菌活性，总阳性率为50.88%，抑菌圈直径范围为7.54～21.81 mm。其中， 12株细菌能抑制甘蔗鞭黑粉菌菌丝生长，占活性菌株总数的41.38%，抑菌圈直径范围为7.54～16.85 mm；14株细菌能抑制甘蔗鞭黑粉菌“+”担孢子增殖，占活性菌株总数的48.28%，抑菌圈直径范围为10.90～21.81 mm；14株细菌能抑制甘蔗鞭黑粉菌“-”担孢子增殖，占活性菌株总数的48.28%，抑菌圈直径范围为10.35～18.50 mm。此外，有9株细菌能同时抑制2～3种甘蔗鞭黑粉菌的形态，即菌丝生长、“-”担孢子增殖、“+”担孢子增殖。以含5 μg/mL啶酰菌胺的DMSO为阳性对照，其抑菌圈直径为17.50～23.00 mm；而以DMSO作阴性对照未出现抑菌圈。

3 讨论

红树植物生长在热带、亚热带海岸潮间带上，海岸潮间带具有高度盐渍化、氧气稀少、强光辐射及周期性海水浸泡等特征，为特色微生物资源提供了巨大的生存空间（Takahashi and Omura，2003）。大量研究报道指出，通过宏基因组技术分析，已获取大量来源于红树林的微生物菌落结构和生物功能信息，在实验室分离培养红树植物中的微生物，仅获得1%的可培养微生物（郭凯旋等，2012；卢乃会等，2013；Santoferrara et al.，2014；林巧玲等，2017）。就目前的技术而言，传统分离方法是获取微生物次级代谢产物及其生物合成途径或代谢通路的关键（Zengler et al.，2002）。本研究选用广西钦州茅尾海红树林保护区内无瓣海桑根际作为研究对象，分离获得57株细菌，隶属于4门5纲9目15科21属。李菲等（2016）从茅尾海无瓣海桑根部中分离得到12株内生细菌，隶属于7科9属。从分离获得的细菌数量和种类来看，根部土壤中分离获得的细菌均远高于根部来源的内生细菌，其可能原因是土壤环境受到植物生长的影响，使得土壤微生物的群落结构和多样性发生改变（殷萌清等，2017；张永夏等，2017），受植被影响的土壤环境中微生物群落多样性比其他未受植被影响的土壤环境中微生物群落多样性丰富。

从茅尾海无瓣海桑根际土壤中分离获得1株Cellvibrio sp.的潜在新菌，其与最近菌株[C. gandavensis R-4069T（AJ289162）]的16S rRNA基因序列相似性低于97.00%。抗菌活性检测结果显示，有29株细菌具有抑制甘蔗鞭黑粉菌活性，总阳性率为50.88%。如BGMRC 0101、BGMRC 0143和BGMRC 0073均隶属于Streptomyces sp.，对甘蔗鞭黑粉菌具有明显活性，其中BGMRC 0101对甘蔗鞭黑粉菌菌丝和“-”担孢子表现出抑制活性，BGMRC 0143对甘蔗鞭黑粉菌“+”和“-”担孢子表现出抑制活性，BGMRC 0073对甘蔗鞭黑粉菌菌丝和“+”担孢子表现出抑制活性。可见，活性菌株与非活性菌株隶属相同门级，相同科级，甚至是相同属级，其抑菌效果也不完全相同。这种差异在一定程度上说明生存环境是自然选择的一个动力，尽管生存环境相同，菌株也会因结构和功能不同而产生代谢差异。因此，下一步需对潜在新菌开展多相分类鉴定，并对生物活性良好的菌株进行优化培养，研究其抑菌机理，以期为新型生物农药的研制提供更多参考依据。

4 結论

广西钦州茅尾海红树林保护区内无瓣海桑根际土壤中可培养细菌具有丰富的物种多样性，并从中挖掘出1株疑是Cellvibrio sp.的潜在新菌，同时挖掘出多株能抑制甘蔗鞭黑粉菌活性的菌株，为进一步研究红树植物根际土壤中细菌的次生代谢产物及研发新型高效生物农药打下基础。

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（責任编辑 罗 丽）