大果沙糖橘的遗传鉴定及引种栽培表现

李果果　陈香玲　秦荣耀　刘要鑫　赵小龙　孙宁静　欧智涛　唐志鹏　张广珍

摘要：【目的】分析大果沙糖橘的遗传特性和引种栽培表现，为丰富广西沙糖橘种类提供参考依据。【方法】利用倍性分析和AFLP分子标记对引种的大果沙糖橘进行遗传鉴定，并观测其生长发育特性和物候期，分析果实的产量和品质性状。【结果】倍性鉴定结果表明，大果沙糖橘的倍性与沙糖橘均为二倍体；AFLP分子标记分析结果表明，大果沙糖橘的遗传物质有别于沙糖橘、广蜜橘、南丰蜜橘、桂青橘1号、青皮橘和春甜橘，具有遗传特异性，是一种新的柑橘种质材料。经2005～2016年栽培观测，大果沙糖橘植株长势旺盛，丰产稳产；平均单果重69.0 g，果实平均纵径40.7 mm，平均横径53.4 mm，果实扁圆形，平均果皮厚2.5 mm，可食率74.4%；平均可溶性固形物含量13.0%，可滴定酸含量0.28%，维生素C（Vc）含量33.2 mg/100 gFW；果皮橙黄至橙红色，油胞凸出，果面稍粗糙，少核，在广西崇左市成熟期为12月。【结论】大果沙糖橘是具有遗传特异性的新型柑橘种质资源，产量较高，稳产性好，品质较佳，适应性强，适合在广西沙糖橘产区推广种植。

关键词： 大果沙糖橘；遗传鉴定；引种；栽培表现

中图分类号： S666 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1171-06

Abstract：【Objective】The genetic character and planting performance of the Citrus cultivar Daguo shatangju was ana-lyzed to provide references in order to enrich the variety of Guangxi Shatangju. 【Method】Ploidy analysis and AFLP molecular marker were used to determine the genetics of Daguo shatangju. The botanical characteristics，phenology，yield and fruit character were observed and analyzed. 【Result】The ploidy analysis result showed that Daguo shatangju was diploid，the same as Shatangju. The AFLP molecular marker showed that the genetic material of Daguo shatangju was different from Shatangju， Guangmiju， Nanfengmiju， Guiqingju No.1， Qingpiju and Chuntianju. It was a new Citrus gerplasm resource. Through observation during 2005-2016，it was found that the growth vigor of Daguo shatangju was flourishing. The yield was high and stable. The average fruit mass was 69.0 g. The fruit was oblate with average longitudinal diameter 40.7 mm and average transverse diameter 53.4 mm. The average pericarp thickness was 2.5 mm，edible rate 74.4%，the average total soluble solids content 13.0%，the acid content 0.28 g and vitamin C（Vc） content 33.2 mg/100 gFW. The fruit peel was orange or salmon. The oil cell was little rough and obvious. It was a few-seed cultivar，mature in December in Chongzuo， Guangxi. 【Conclusion】Daguo shatangju is a new Citrus gerplasm resource with genetic specificity，which can be grown extendedly throughout Guangxi Shatangju planting areas due to its high yield，stability， good quality and strong adaptability.

Key words： Daguo shatangju； genetic identification； introduction； cultivation performance

0 引言

【研究意義】沙糖橘原产广东省四会市，广西于1994年引种，迄今已成为广西柑橘主要栽培品种之一。据不完全统计，截至2014年广西沙糖橘栽培面积约6. 67万ha，产量约100万t（区善汉等，2014；张锦松等，2015），但存在品种单一、果实偏小等问题，未能满足市场需求。广西大学和广西农业科学院园艺研究所于2011年在广西崇左市柑橘园实地调查时发现大果型沙糖橘品系，此后经过多年观察和分析，大果型沙糖橘在叶片、枝条和果实大小等方面与沙糖橘存在明显差异，具有品种特异性，是沙糖橘大果型新品系，被命名为大果沙糖橘，2015年通过广西壮族自治区农作物品种审定委员会审定（编号2015001号），但对其遗传特性鉴定的研究未见报道。果树遗传鉴定方法主要有流式细胞术、RAPD、SSR、AFLP、MSAP和基于反转录转座子的标记，其中AFLP作为重复性和稳定性较好的分子标记技术，能提供较多的信息量，在柑橘变异材料的鉴定中应用较广泛（张敏和邓秀新，2006）。流式细胞术是一种较快速鉴定果树倍性的方法，操作简单，已普遍应用于果树遗传鉴定（谢宗周等，2010；傅翠娜等，2014）。因此，利用流式细胞术和AFLP分子标记鉴定大果沙糖橘的遗传特性，分析其引种栽培表现，对丰富广西沙糖橘种类具有重要意义。【前人研究进展】20世纪80年代，华南农业大学的陈大成以十月橘（二倍体）嫁接苗为试材，通过秋水仙素诱变处理获得四倍体十月橘，果实单果重72.8 g，果形指数0.75（甘廉生和唐小浪，2013），是目前唯一报道的大果型沙糖橘品系。采用流式细胞仪对植物材料的DNA倍性进行分析，结果准确度高，且DNA含量可在分布图上直观体现（张俊娥等，2003）。谢宗周等（2010）利用流式细胞仪检测确定桂橙1号为二倍体。AFLP技术是迄今最有效的分子标记方法，操作方便快速，只需极少量DNA材料即可检测整个基因组的遗传变异，已广泛应用于果树遗传多样性研究和品系鉴定，如王平等（2012）应用AFLP技术对16个辐射诱变和芽变的柑橘品系及其亲本进行遗传差异分析，发现16个变异材料的遗传基础均发生了不同程度变异；肖远辉等（2012）从64对引物中筛选出12对AFLP引物组合，能将12份柚类材料区分开，从而证实早熟沙田柚和桂柚1号是不同于沙田柚的变异新种质，可直接作为品种资源加以利用。【本研究切入点】目前，针对大果沙糖橘遗传鉴定、生长发育特性和引种栽培表现的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】对广西崇左市引进的大果沙糖橘进行遗传鉴定，观测其生长发育特性、物候期和果实性状等栽培表现，为大果沙糖橘在广西的推广种植提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验地概况

试验于2011年12月～2016年12月在崇左市江洲区左江华侨农场区扶分场进行。崇左市地处北回归线以南，属亚热带湿润季风区，年日照时数1600 h，年均气温20.8～22.4 ℃，年无霜期340 d，年降水量1200 mm以上，光照充足，雨热同季（覃妙龄等，2013）。土壤质地为酸性土壤，pH 5.1，有机质含量24.3 g/kg，全氮含量0.133%，水解氮含量93.0 mg/kg，速效钾含量130.0 mg/kg，有效磷含量33.6 mg/kg。

1. 2 试验材料

试验树于2005年从广东省英德市英德农场引进种植，砧木为枳壳，株行距2.0 m×3.5 m（按1425株/ha种植）。于2011年开始对7年生树进行倍性分析、利用AFLP分子标记进行遗传多样性鉴定及其观测引种表现。

1. 3 试验方法

1. 3. 1 倍性分析 参照张俊娥等（2003）的方法，采用PA-I流式细胞仪（德国Partec公司）对试验树进行倍性检测，以二倍体早花柠檬的叶片为对照。具体检测方法：选取约0.5 cm2幼嫩叶片于塑料皿中，加入400.0 μL HR-A核裂解液，用刀片切碎叶片后放置30 s，以20.0～50.0 μL微孔滤膜将样品过滤到小试管中，加入1.6 mL HR-B DAPI染色液染色30～60 s，然后上样品检测。采用PA-I流式细胞仪测定样品中单个细胞核的DNA总量，DNA含量的分布曲线由仪器自动生成（谢宗周等，2010）。

1. 3. 2 AFLP分子标记鉴定 参考肖远辉等（2012）的方法，稍加改良，采用AFLP分子标记对试验树、沙糖橘、广蜜橘、南丰蜜橘、桂青橘1号、青皮橘和春甜橘进行DNA提取、限制性酶切及连接反应、预扩增和选择性扩增比较，以确定试验树的遗传特异性。

1. 3. 3 栽培表现观测 2011～2016年期间对大果沙糖橘进行生长发育性状观察，并进行果实产量统计和品质分析。参照王武等（2013）的方法，选取生长势一致的5株健康试验树，于果实成熟期在每株树的树冠外围中部随机采摘6个果实，合计30个果实，带回实验室备用。参照出口柑橘鲜果检验方法（GB/T 8210-1987）要求进行果品分析，其中，可溶性固形物含量采用数显PAL-1测糖仪测定，可滴定酸含量采用NaOH指示剂法测定，维生素C（Vc）含量采用2，6-二氯靛酚滴定法测定。

平均产量（kg/ha）=平均单株产量（kg/株）×实际

株数（株/ha）

1. 4 统计分析

利用GeneScan读取电泳检测获得的指纹图谱，以NTSYS-pc 2.1对读取的数据进行分析，利用Dice相似系数进行计算，得到相似系数矩阵和聚类分析图；果品分析数据采用Excel 2010和DPS v14.10进行统计分析，以 t 测验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 倍性分析结果

倍性分析结果表明，试验树的倍性与早花柠檬相同，均为二倍体样本（图1）。说明大果沙糖橘与沙糖橘在倍性上无差异，均为二倍体，其单果重增加不是因为倍性增加所致，与华南农业大学选育的四倍体沙糖橘差异明显。

2. 2 AFLP选择性扩增结果

从64对AFLP引物中筛选出8对重复性好、条带清晰的引物，对供试柑橘材料的基因组DNA进行扩增（图2），8对引物共扩增出791条清晰条带，每对引物扩增条带数为49～171条，平均每对引物扩增条带数为98.88条，其中多态性条带709条，多态性比例为89.63%（表1），说明8对引物能很好地将大果沙糖橘与其他柑橘材料区分开来。

2. 3 相似系数及聚类分析

从表2可看出，供试材料两两间遗传相似系数为0.5121～0.6434，其中大果沙糖橘与沙糖橘的Dice相似系数为0.6434，说明其亲缘关系较近，沙糖橘与春甜橘的Dice相似系数为0.5121，说明其亲缘关系较远；以0.5640为相似系数的阈值，可将供试材料分为3类（图3），其中广蜜橘和南丰蜜桔归为一类，桂青橘1号、大果沙糖橘、青皮橘和春甜橘归为一类，沙糖橘归为一类。鉴于大果沙糖橘与沙糖橘的亲缘关系最近（Dice相似系数为0.6434），与春甜橘的亲缘关系最远（Dice相似系数为0.5202），因此可认定大果砂糖橘是不同于其他柑橘材料的变异新种质。

2. 4 大果沙糖橘的植物学和生物学特性

观测发现，大果沙糖橘成年结果树株高3.5～4.5 m，树冠呈圆头形，树势较旺，半开张，冠幅2.8 m×3.5 m，主干光滑，深褐色；枝条长21.0～61.0 cm，平均41.0 cm，径粗2.9～5.5 mm，平均3.8 mm，刺较少且不明显；叶片卵圆形，长7.0～9.5 cm，宽4.0～6.0 cm，叶色浓绿，老叶叶尖钝圆，嫩叶叶尖渐尖，尖部较长，叶缘锯齿状，波浪不明显，翼叶线形而明显；花为完全花，白色，花瓣5瓣，长椭圆形，先端反卷，花径1.4～3.0 cm，花药15个，雌蕊同雄蕊等高或稍高，子房浅绿色，近圓形。

在广西崇左地区，大果沙糖橘幼龄树枝梢一年抽发5次，分别为春梢1次，夏梢2次，秋梢1次，冬梢1次，成年结果树枝梢一年抽发3次，分别为春梢1次，夏梢1次，秋梢1次。春梢萌芽期在2月上、中旬，夏梢在5月中旬，秋梢在8月上、中旬。1年生秋梢或晚夏梢是主要的结果母枝，1年生老熟的春梢和夏梢也可成为结果母枝，以25.0～50.0 cm的枝梢为理想的结果母枝长度。初花期在3月上旬，盛花期在3月中旬，末花期在3月下旬～4月上旬，果实成熟期在12月。

2. 5 果实产量测定和品质分析

2013～2016年测产结果，大果沙糖橘产量分别为136425、115961、129603和143246 kg/ha，平均131309 kg/ha；果实扁圆形，果形指数0.76，单果重53.0～90.0 g。大果沙糖橘果皮橙黄至橙红色，油胞明显，较沙糖橘果皮粗糙，肉质爽脆，汁多化渣，高糖低酸，风味佳。平均单果重69.0 g，显著高于沙糖橘79.2%（P<0.05，下同）；平均纵径（40.7 mm）和横径（53.4 mm）也显著大于沙糖橘，果皮厚度（2.5 mm）、可食率（74.4%）、可溶性固形物含量（13.0%）、可滴定酸含量（0.28%）和Vc含量（33.2 mg/100 gFW）与沙糖橘无显著差异（P>0.05）（表4）。

3 讨论

流式细胞仪倍性分析技术已应用于常规杂交育种（解凯东等，2014）、原生质体融合（陈智炜，2016）、体细胞融合（张亚莎，2016）及组织再生（王子成和李忠爱，2007；阮氏雪，2011）材料的倍性鉴定。本研究中崇左市左江华侨农场引种的大果沙糖橘平均单果重为69.0 g，与广东东莞市清溪镇大面积栽培的四倍体沙糖橘单果重72.8 g相当（甘廉生和唐小浪，2013），利用流式细胞仪倍性分析技术鉴定其属于二倍体，与四倍体沙糖橘差异明显。

AFLP作为一种检测DNA多态性的高效分子标记已被广泛应用于果树的遗传多样性和亲缘关系鉴定、种质鉴定、遗传图谱构建、基因标记及辅助育种选择（吴俊等，2004）。王平等（2012）利用AFLP技术进行遗传差异分析发现，广东省新选育16个柑橘优良品系（株系）的遗传基础均发生了不同程度的变化。傅翠娜等（2014）研究表明，选用12对AFLP引物组合对金柑资源进行遗传多样性分析和分类，能很好地将8份金柑资源区分开来。本研究结果表明，采用8对AFLP引物组合可将大果沙糖橘与沙糖橘、广蜜桔、南丰蜜桔、桂青橘1号、青皮橘和春甜橘等柑橘品种在分子水平上进行区分，说明利用AFLP分子标记检测柑橘芽变等变异材料有效。

大果沙糖橘的枝条明显长于沙糖橘，叶片明显大于沙糖橘，花的大小与沙糖橘一致（甘廉生和唐小浪，2013），单果重显著重于沙糖橘，发芽抽梢、开花结果和果实成熟等物候期与沙糖橘一致。

近年来，广西地区柑橘产业发展迅速，可实现柑果周年上市，产量从2010年的349万t增加到2015年的472万t，从当年7月的特早熟温州蜜柑到次年6月的夏橙，每月均有柑橘上市（袁琳和王举兵，2016）。其中，沙糖橘的种植面积和产量均居广西各柑橘品种首位，但其成熟期为12月，是柑橘集中大量上市时期。本研究鉴定的大果沙糖橘稳产丰产，品质上乘，成熟期与沙糖橘一致，具有一定的市场竞争优势，但尚不能进行产期调控，因此，还应继续挖掘大果沙糖橘的潜在价值，以期选育出熟期存在差异的沙糖橘新品系（种）。

4 结论

大果沙糖橘是具有遗传特异性的二倍体柑橘种质资源，单果重较沙糖橘高，高产稳产，口感与沙糖橘相当，味甜，汁多，适宜在广西沙糖橘产区推广种植。

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（责任编辑 思利华）