杉木优良无性系组培技术体系的建立

秦丽凤

摘要：【目的】建立杉木（Cunninghamia lanceolata）優良无性系组培快繁技术体系，为杉木规模化育苗提供技术支持。【方法】以桂林市全州县15年生优良杉木单株基部或根部萌芽条的茎尖为外植体，筛选最佳HgCl2浸泡灭菌时间；以1/2MS为基本培养基添加不同激素组合进行芽的诱导和增殖，以1/4MS为基本培养基添加不同生长素或生长素组合进行生根培养，筛选适宜杉木组织培养和快繁的培养基。【结果】在改良培养基1/2MS+0.8 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.3 mg/L吲哚丁酸（IBA）中，杉木茎尖芽的诱导率达74.3%，平均芽长达2.3 cm；在改良培养基1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA中，杉木茎尖诱导芽的继代培养增殖倍数适中，增殖芽生长较快，有效苗数较多；在改良培养基1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT 6号生根粉中，杉木继代苗的生根率达90.7%。【结论】6-BA质量浓度是影响杉木外植体诱导率的主要因素，同时影响新芽的萌发数量；IBA则主要影响新芽的生长速度。适宜质量浓度的生长素可促进杉木组培苗生根，但质量浓度过高会抑制苗木生根。在实际生产中，以1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA为杉木茎尖芽诱导和生长的培养基、1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA为杉木茎尖诱导芽的继代增殖培养基、1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT 6号生根粉为杉木组培苗的生根培养基，可实现杉木优良无性系规模化育苗。

关键词： 杉木；无性系；组培快繁

中图分类号： S791.27 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1183-06

Abstract：【Objective】A Cunninghamia lanceolata superior clone rapid propagation technology system was established to provide technical for large-scale C. lanceolata seedling production. 【Method】Using stem tip of stem base or root germination branch of 15-year C. lanceolata in Quanzhou， Guilin as the explants，the optimal HgCl2 soaking sterilization time was selected， and buds were induced and proliferated by adding different hormone combinations to 1/2MS as the basic medium， and different auxins or auxin combinations were added to 1/4MS as the basic medium for rooting culture，in order to screen out the appropriate medium in tissue culture of C. lanceolata. 【Result】The induction rate of bud of C. lanceolata stem tip was 74.3% and the average length of induced buds was 2.3 cm in culture medium of 1/2MS+0.8 mg/L 6-benzylaminopurine（6-BA）+0.3 mg/L indole butyric acid（IBA）. In culture medium 1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA， the subculture multiplication number of the induced buds was moderate， the bud growth was fast and effective bacteria number was large. Rooting rate of C. lanceolata subculture seedlings could be up to 90.7% in culture medium of 1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT No.6 rooting powder. 【Conclusion】6-BA mass concentration is the main factor that affects induction rate of C. lanceolata explant， and also affects germination number of buds. IBA mainly affects growth speed of the buds. The proper mass concentration of auxin can promote rooting of C. lanceolata tissue culture seedlings， but high mass concentration auxin inhibits the rooting. In actual production， using 1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA as medium for induction and growth of bud of C. lanceolata stem tip， 1/2MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA as subculture medium for induced bud of C. lanceolata stem tip and 1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT No.6 rooting powder as rooting medium for tissue culture seedling of C. lanceolata， large-scale C. lanceolata superior clone seedling production can be realized.

Key words： Cunninghamia lanceolata； superior clone； rapid propagation

0 引言

【研究意义】杉木（Cunninghamia lanceolata）是我国南方主要的速生用材树种，生长快，产量高，干形通直圆满，木材紋理通直，材质轻韧，气味芳香，抗虫耐腐（刘建忠等，2016）。选择优良无性系进行扩大繁殖是发挥森林潜能、提高森林生产力及促进林木速生丰产的有效措施，而采用组培育苗，可不受杉木优良种源种子产量低的限制，随时满足造林户对优质种苗的需求，提高林农造林的积极性。目前关于杉木优良无性系组培研究的报道较多（蔡玲等，2013，2016；张建华，2014；李峰卿等，2017），但不同产地杉木优良无性系的遗传性状存在差异，其在组培中的增殖率和生根率也存在明显差异，极大影响杉木优良无性系组培苗在生产上的推广应用。因此，建立以桂林市全州县15年生优良杉木单株的组培快繁技术体系，对广西杉木规模化育苗具有重要意义。【前人研究进展】陈剑勇（2009）以杉木优良单株基部萌蘖条茎尖为外植体进行组培快繁试验，筛选出愈伤组织诱导、不定芽分化增殖及生根的培养基分别为MS+0.2 mg/L 6-糖基腺嘌呤（KT）+1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、MS+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L吲哚丁酸（IBA）和1/2MS+0.5 mg/L萘乙酸（NAA）+0.2 mg/L IBA。林景泉（2011）研究表明，1/3MS+0.7 mg/L 6-苄基氨基嘌呤（6-BA）+0.5 mg/L IBA+30.0 g/L蔗糖为较佳的杉木组培苗增殖培养基，1/2MS+0.4 mg/L NAA+1.2 mg/L IBA+30.0 g/L蔗糖为较佳的杉木组培苗生根培养基。付婷和李柏林（2013）研究发现，不同杉木优良无性系树干基部萌条的茎尖在相同类型培养基、相同活性炭和激素组合中增殖系数不同；添加活性炭可减少玻璃化现象，但作用时间过长会使组培苗老化。蔡玲等（2016）研究发现，适宜杉木优良无性系柳327丛芽继代增殖的培养基为1/2MS+0.7 mg/L 6-BA+0.3 mg/L KT+0.1 mg/L IBA，生根培养基为1/2MS+100.0 mg/L KH2PO4+3.0 mg/L吲哚乙酸（IAA）+2.0 mg/L IBA+0.8 mg/L ABT 6号生根粉。刘海鹰等（2016）研究发现，杉木优良无性系最佳初代诱导基本培养基为MS，最适增殖诱导培养基为MS+0.5～0.7 mg/L 6-BA+0～0.2 mg/L IBA，最适生根培养基为1/2MS～1/4MS+0.5～1.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA，最适杉木组培苗移栽基质为泥炭土∶黄心土∶蛭石=4∶2∶1混合土。李峰卿等（2017）研究发现，最适杉木优良无性系继代增殖培养基为DCR+0.4 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA，最佳生根培养基为1/4DCR+0.8 mg/L NAA。【本研究切入点】不同杉木无性系的遗传差异致使其对激素的敏感性不同，最适诱导、继代增殖和生根培养的培养基配方也有所不同，而目前针对桂林市优良杉木单株进行规模化组培快繁的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以桂林市全州县15年生优良杉木单株基部或根部萌芽条茎尖为外植体，采用添加不同激素组合的培养基进行诱导、增殖和生根培养，建立杉木优良无性系组培技术体系，为广西杉木规模化育苗提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

试验用外植体为杉木茎尖，采自桂林市全州县咸水林场1.5代杉木种子园自由授粉子代测定林优良家系中的15年生优良单株基部或根部萌芽条。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 培养基及培养条件设计 参考前人研究结果（郑仁华，2008），以1/2MS为杉木茎尖诱导和增殖的基本培养基，添加2.5%蔗糖和4.8 g/L琼脂；以1/4 MS为杉木茎尖增殖苗的生根培养基，添加1.5%蔗糖和5.0 g/L卡拉胶。培养基pH 5.6。所用抗氧化剂为抗坏血酸（Vc）和核黄素（VB2）。高温灭菌15～20 min。培养室温度（25±2）℃，光照时间12～14 h/d，光照强度2000 lx。设3次重复，统计数据取3次重复的平均值。

1. 2. 2 外植体表面消毒及灭菌 于天气晴朗时采集萌芽条，剪除密集的针叶，用0.2%洗洁精溶液刷洗表面尘埃，然后用0.1%新洁尔灭溶液浸泡30 min，纯净水冲洗3～5次，剪切成长2.0 cm的茎段，纯净水清洗2～3次后置于超净台上用75%酒精浸泡30 s进行消毒，无菌水清洗1次，再用0.1% HgCl2溶液分别浸泡5、8、12和15 min进行灭菌，边浸泡边振荡，无菌水清洗4～5次后，分别接种于诱导培养基上进行腋芽诱导培养，每5 d观察记录1次外植体的污染、褐化和芽萌动情况，培养50 d后统计其污染率、褐化率和诱导率。

1. 2. 3 诱导培养及培养基优化 诱导培养基中分别添加不同质量浓度6-BA（0.3、0.6、0.8和1.2 mg/L）和IBA（0.1、0.3和0.5 mg/L），共12个处理，每处理接种50个经表面消毒灭菌的外植体进行光照培养和暗培养试验（接种后在黑暗中培养10 d再转入光照培养）。根据试验结果继续对诱导培养基进行优化调整，各处理统一培养60 d后统计外植体的萌芽率（萌芽的外植体数占接种外植体总数的百分率）、萌芽外植体的平均出芽数及平均芽长。

1. 2. 4 继代增殖培养及培养基优化 诱导培养40～50 d、新芽长至2.0 cm以上时，转入继代培养基中培养。继代培养基中分别添加不同质量浓度6-BA（0.3、0.6、0.8和1.2 mg/L）和IBA（0.1、0.3和0.5 mg/L），共12个处理，每处理接种20瓶，每瓶接种2个新芽。继代培养5代后统计各处理芽数和增殖倍数（每处理芽的总数/第1次转接时芽的个数/继代次数）观察每处理的有效苗数（苗高2.0 cm以上、生长健壮的芽总数）和丛生芽数，根据试验结果继续对培养基进行优化调节。

1. 2. 5 生根培养 将继代培养中芽长2.0 cm以上的有效芽转至生根培养基中进行生根培养。设13个处理，分别为：1/4MS+0.5 mg/L NAA，1/4MS+1.0 mg/L NAA，1/4MS+2.0 mg/L NAA，1/4MS+0.5 mg/L IBA，1/4MS+1.0 mg/L IBA，1/4MS+2.0 mg/L IBA，1/4MS+0.5 mg/L ABT6，1/4MS+1.0 mg/L ABT6，1/4MS+2.0 mg/L ABT6，1/4MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA，1/4MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L ABT6，1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT6，1/4MS（不添加任何激素）。各处理培养40 d后统计生根率、平均根长和平均根条数，记录生根时间（转入生根培养基至开始出根的天数）和观察苗的生长情况。

1. 3 统计分析

试验数据采用Excel 2007进行统计及相关性分析。

2 结果与分析

2. 1 HgCl2浸泡灭菌时间对杉木外植体表面灭菌效果的影响

由表1可知，随着HgCl2浸泡灭菌时间的延长，杉木外植体的褐化率有所增加，污染率下降，芽的诱导率呈先上升后下降的变化趋势。其中，灭菌8 min处理芽的诱导率达60.3%，显著高于其他灭菌时间处理（P<0.05，下同）；褐化率为12.5%，显著低于灭菌12和15 min处理，与灭菌5 min处理差异不显著（P>0.05，下同）；污染率为27.2%，显著低于灭菌5 min处理，显著高于灭菌15 min处理，与灭菌12 min处理差异不显著。说明杉木外植体的最佳HgCl2浸泡灭菌时间为8 min。

2. 2 光照对杉木外植体诱导的影响

由表2可知，外植体接种后暗培养10 d再转入光照培养，其褐化率比直接光照培养显著降低10.4%（绝对值，下同），但其诱导率显著提高11.2%，直接光照培养及暗培养10 d后转入光照培养对其污染率和萌芽率的影响无显著差异。可见，暗培养能有效降低杉木外植体褐化程度，提高芽的诱导率。

2. 3 不同质量浓度6-BA和IBA组合对杉木外植体诱导的影响

由表3可知，培养基中添加不同质量浓度的6-BA和IBA，外植体的诱导率、萌芽率和生长状况均存在一定差异。对不同质量浓度6-BA和IBA组合处理外植体的萌芽率进行方差分析和极差分析，结果（表4）表明，依据P值的大小可判断，6-BA质量浓度对杉木外植体萌芽率的影响达极显著水平（P=2.09E-0.5<0.01），而IBA质量浓度对杉木外植体萌芽率的影响（P=0.201658>0.05）不显著；从K值判断，6-BA以0.8 mg/L处理的萌芽率最理想（K3=83.0），IBA以0.3 mg/L处理的萌芽率最理想（K2=63.3）。说明在1/2MS中，杉木外植体芽诱导的最佳激素组合为0.8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA。

2. 4 不同质量浓度6-BA和IBA组合对杉木芽继代增殖的影响

由表5可知，随着6-BA和IBA质量浓度的增加，杉木芽继代苗的生长速度逐渐减慢，丛生芽数增多，有效苗数减少。对不同质量浓度6-BA和IBA组合处理杉木芽继代苗的增殖倍数进行方差分析和极差分析，结果（表6）表明，依据P值判断，6-BA质量浓度对杉木芽继代苗增殖倍数的影响达极显著水平（P=2.09E-0.5<0.01），IBA质量浓度对杉木芽继代苗增殖倍数的影响不显著（P=0.201658>0.05）；从K值判断，6-BA以1.2和0.8 mg/L处理的增殖倍数较理想（K4=2.877，K3=2.600），0.6 mg/L处理次之（K2=2.283），0.3 mg/L处理不理想（K1=1.683）；IBA以0.5 mg/L处理的增殖倍数较理想（K3=2.473），0.3 mg/L处理次之（K2=2.458），0.1 mg/L处理不理想（K1=2.153）。综合考虑1.2和0.8 mg/L 6-BA处理、0.5 mg/L IBA处理的继代增殖芽生长速度慢，有效苗数较少，而0.6 mg/L 6-BA处理、0.3 mg/L IBA处理的增殖芽生長速度较快，有效苗数较多，因此选定0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA为杉木芽继代增殖最佳激素组合，即在1/2MS中添加0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA进行杉木芽继代增殖，符合工厂化育苗要求。

2. 5 生根培养基中添加生长素对杉木增殖苗生根的影响

从表7可知，生根培养基中添加激素对杉木生根有明显的促进作用，生根率明显提高，生根时间缩短；生根培养基中同时添加两种生长素的生根率总体上较仅添加单一生长素的高，生根时间普遍缩短。

生根培养基中添加单一生长素时，总体上以添加IBA的生根率较高，其中以添加1.0 mg/L IBA的生根率最高，为78.0%，生根时间较短，根长适中，生根数最多；添加NAA的生根效果普遍较差，其中以添加2.0 mg/L NAA的生根率最低，仅24.5%，生根时间较长，根长较短，生根数较少。生根培养基中同时添加两种生长素时，以添加0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT6 的生根率最高，达90.7%，生根时间最短，根长最长，生根数适中；添加0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L ABT6的生根率最低，为70.2%，根长和生根数适中。对添加不同生长素处理的生根率进行方差分析，结果（表8）表明，生根培养基中添加不同生长素对杉木继代苗生根率的影响达极显著水平（P=0.000396<0.01）。说明1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT6 为杉木继代苗生根最佳培养基。

3 讨论

初代培养时经常遇到褐变现象，主要是外植体切口表面渗出的酚类物质在光照条件下氧化成醌类物质而引起（王玉英和高新一，2006），因此开始时把外植体置于黑暗处，待其切口愈合、外渗停止后再转入光照下培养可降低褐化程度（郑仁华，2008），本研究也获得了相似研究结果，即以杉木茎尖为外植体进行暗培养可有效降低其褐化程度，提高诱导率。

杉木外植体诱导、继代增殖和生根受外界培养条件的影响较明显。本研究在1/2MS培养基中添加不同质量浓度6-BA和IBA组合，外植体的诱导率、萌芽率和生长状况均存在明显差异，其中6-BA质量浓度是影响杉木外植体诱导率的主要因素，与曾雷等（2009）的研究结果一致；在继代增殖培养过程中，6-BA和IBA质量浓度对杉木继代苗增殖具有重要影响，6-BA主要影响新芽的萌发数量，IBA主要影响新芽的生长速度，与郑仁华（2008）的研究结果一致；在生根培养过程中，适宜质量浓度的生长素可促进杉木组培苗生根，但质量浓度过高会抑制苗木生根，与郑仁华（2008）、林景泉（2011）、韦如萍等（2013）研究认为不同生长素间的交互效应对杉木组培苗生根影响明显，生根培养时添加生长素的浓度和比例有较严格要求的观点相似。

本研究仅以桂林市全州县1.5代杉木种子园自由授粉子代测定林选出优良家系中的15年生优良单株基部或根部萌芽条茎尖为外植体建立杉木优良无性系组培技术体系，在今后的研究中还需进一步筛选更优良的无性系，选择诱导率高、增殖和生长速度快、生根率和移栽成活率高的優良无性系用于组培快繁。

4 结论

6-BA质量浓度是影响杉木外植体诱导率的主要因素，同时影响新芽的萌发数量；IBA则主要影响新芽的生长速度。适宜浓度的生长素可促进杉木组培苗生长，但质量浓度过高会抑制苗木生根。在实际生产中，以改良培养基1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA为杉木茎尖芽诱导和生长的培养基、1/2 MS+0.6 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA为杉木茎尖诱导芽的继代增殖培养基、1/4MS+0.5 mg/L IBA+1.0 mg/L ABT6为杉木组培苗的生根培养基，可实现杉木优良无性系规模化育苗。

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（责任编辑 思利华）