家蚕病原性微孢子虫多样性调查分析

黄旭华　罗梅兰　汤庆坤　王桂文　黄深惠　潘国庆　蒋师东　夏青　王霞　毛洪斌　潘志新

摘要：【目的】從分布、感染性和分类特征三方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性，为蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病提供参考依据。【方法】跟踪蚕种生产微粒子病检疫数据及抽样检验家蚕受微孢子虫感染的情况，调查家蚕病原性微孢子虫的分布；通过测定微孢子虫对家蚕的半数感染浓度（IC50）和胚种传染率及检验带毒蚕种的微粒子病胚种传染率，调查家蚕病原性微孢子虫的感染性；基于微孢子虫SSU rRNA序列构建家蚕病原性微孢子虫系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析，调查家蚕病原性微孢子虫的分类特征。【结果】不同时间和不同蚕区生产饲养的广西家蚕均存在一定量的微孢子虫感染，蚕种微粒子病发生率（毒率）呈波动起伏态势。GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等11株异型微孢子虫对家蚕均具有较强食下传染力，大部分异型微孢子虫对家蚕的IC50与N.b同一级别；各种微孢子虫对家蚕的胚种传染力存在明显差异，N.b的胚种传染率达51.67%，其他异型微孢子虫均比N.b低，部分异型微孢子虫（GXM6和GXM13）对家蚕无胚种传染力。GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等8株异型微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上，除GXM7与GXM9、GXM3与GXM5间存在较低分化度和较高相似度外，其他微孢子虫间的分化度和相似度均存在明显差异。【结论】广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛，种类繁多，且各种微孢子虫的感染力存在明显差异，即广西家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性。

关键词： 家蚕；病原性微孢子虫；感染性；分类地位；多样性

中图分类号： S884.21 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1208-07

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to survey the diversity of pathogenic microsporidan of Bombyx mori from the perspectives of their distribution， infectivity and taxonomic character to provide reference for effective prevention of bombyx m. pebrine in sericulture. 【Method】The pebrine inspection data of B. mori eggs was analyzed and the sampling inspection of B. mori was carried out to find out the distribution of pathogenic microsporidan. The infectivity of pathogenic microsporidan was researched according to test the semi-infection concentration（IC50）， germinative infection rate and germinative infection rate of susceptible B. mori eggs. Phylogenetic tree of microsporidan was construc-ted based on SSU rRNA sequences， analysis on similarity and genetic distance was also carried out to investigate the classification characters of pathogenic microsporidan. 【Result】There were some diseased B. mori being infected by microsporidan in different times and different regions， the pebrine contamination rate（poison rate） of B. mori eggs had obvious fluctuation. The pathogenic microsporidan all had strong ingestive infection to B. mori， such as GXM3， GXM4， GXM5， GXM6， GXM7， GXM8， GXM9， GXM10， GXM11， GXM12 and GXM13， the IC50 of most microsporidan had the same level as N.b， but there were obvious differences in the germinative infection between various pathogenic microsporidan. The germinative infection rate of N.b was 51.67%， which was more than that of other pathogenic microsporidan. Some microsporidan had no germinative infection to B. mori， such as GXM6 and GXM13. There were eight pathogenic microsporidan that were all located in the Nosema family in phylogenetic tree， which were GXM3， GXM4， GXM5， GXM6， GXM7， GXM8， GXM9 and GXM11. They showed obvious differences in divergence and percent identity with other pathogenic microsporidan， expect that there were low divergence and high level of identity between GXM7 and GXM9， GXM3 and GXM5. 【Conclusion】There is wide distribution and variety for the pathogenic microsporidan of B. mori in Guangxi sericulture， and their infection had obvious differences， which means the pathogenic microsporidan of B. mori in Guangxi sericulture have rich diversity.

Key words： Bombyx mori； pathogenic microsporidan； infection； taxonomic status； diversity

0 引言

【研究意义】微孢子虫（Microsporidian）属于细胞真核生物，其寄主范围非常广泛，从无脊椎动物到脊椎动物几乎所有动物类群均可感染（Mathis，2000）。目前，已发现并命名的微孢子虫种类超过1400种，分别归属于150个属（Franzen，2008），其中超过50%微孢子虫种属的典型寄主是昆虫，因此微孢子虫又被称为嗜昆虫病原（刘吉平和曾玲，2006）。昆虫微孢子虫是一种常见的生物病原，开展昆虫微孢子虫多样性调查，对其开发利用或有效防控具有重要的指导作用。【前人研究进展】微孢子虫感染对调节和控制昆虫的种群数量起重要作用，如蝗虫微孢子虫在草地蝗灾的可持续治理中已显示出显著控制效果（张龙，1999），也有利用微孢子虫感染控制棉铃虫、玉米螟等虫害的研究报道（王玉强，2015）。但与此同时，微孢子虫对经济昆虫的寄生带来毁灭性危害，如19世纪中叶因暴发家蚕微粒子病给欧洲蚕业造成毁灭性打击（刘吉平和徐兴耀，2000），目前各蚕区蚕种生产由于微孢子虫感染也淘汰大量蚕种；此外，微孢子虫对家养蜜蜂和野外熊蜂的感染危害存在影响作物授粉效果及降低世界粮食产量的风险（Fürst et al.，2014）。经过长期的演化，昆虫微孢子虫呈现出丰富的物种多样性和复杂的交叉传染性。1967～1979年日本学者广濑安春曾在东京日野市长崎县桑园调查约25000头野外昆虫（共102种昆虫），结果发现检出微孢子虫的昆虫有65种，其中从12种昆虫体内分离获得的微孢子虫对家蚕具有感染力（周泽扬等，2014）。国内学者郑祥明等（2003）于1995～1998年在桑园、菜地及蚕房附近收集389种昆虫约20000多头，结果在51种昆虫中发现了54种微孢子虫，其中18种可经口感染家蚕；Huang等（2014）从广西桑园周围稻田内收集的稻纵卷叶螟中分离获得2株微孢子虫，并证实其对家蚕均具有较强感染性；蓝必忠等（2016）从桑尺蠖中分离获得6株微孢子虫，研究证实其中3株微孢子虫对家蚕具有感染性；汤庆坤等（2017）也从桑园桑螟中分离获得4株对家蚕具有感染性的微孢子虫。【本研究切入点】家蚕是一种重要的经济昆虫，也存在微孢子虫感染的风险，而蚕种生产必须进行微粒子病检疫。因此，跟踪蚕种微粒子病检疫，从分布、感染性和分类特征等方面调查家蚕病原性微孢子虫的多样性，对保障桑蚕产业持续健康发展具有重要意义。【拟解决的关键问题】通过跟踪蚕种生产微粒子病检疫数据及抽样检验家蚕受微孢子虫感染的情况，测定微孢子虫对家蚕的半数感染浓度（IC50）和胚种传染率，并基于微孢子虫SSU rRNA序列进行相似性和遗传距离分析，以期从分布、感染性和分类特征三方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性，为蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试家蚕品种为932×芙蓉。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，N.b）由广西蚕业科学研究院蚕病室继代保存；异型微孢子虫GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13均是在广西蚕种母蛾检疫中发现，从染病母蛾产卵孵化的蚁蚕中收集而得。以各种微孢子虫接种蚕体继代繁殖，并参照黄少康和鲁兴萌（2004）的方法进行提纯。

1. 2 广西家蚕病原性微孢子虫发生情况调查

采取两种方式调查广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布情况：（1）收集2007～2016年广西桑蚕原种及一代杂交种的蚕种生产微粒子病检疫数据，调查蚕种繁育中家蚕感染微粒子病的发生率（毒率），分析广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布情况和特点，并收集保存各种异型微孢子虫样品；（2）2016～2017年在南宁市、贵港市、柳州市、河池市和百色市蠶区设点收集饲养家蚕样品，检测微孢子虫感染情况。

1. 3 异型微孢子虫对家蚕的感染力调查

1. 3. 1 异型微孢子虫对家蚕的食下感染力测定 分别将GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等异型微孢子虫的孢子液梯度稀释成107～103个/mL的10倍系列稀释液，再取各稀释浓度的孢子液0.2 mL，涂抹在2张面积为8 cm2的桑叶片上，饲喂30头（1小区）二龄起蚕，每小区3个重复。待蚕儿吃尽带毒桑叶后，更换蚕座，改用经含0.5%有效氯的漂白粉精溶液浸泡消毒10 min的洁净桑叶饲养至五龄第2 d，对试验区的所有蚕儿逐头研磨镜检，调查感染率，以N.b感染为对照。采用Reed-Muench法计算IC50（王彦文等，2002）。

1. 3. 2 异型微孢子虫对家蚕的胚种传染力调查 以GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12、GXM13和N.b等微孢子虫的孢子液（孢子浓度1.5×106个/mL）分别给四龄起蚕经口接种，常规条件下桑叶饲育至上蔟，并保护至化蛹、化蛾，单蛾制种并镜检，将每种微孢子虫感染严重的3头母蛾所产卵圈进行即时浸酸处理后催青，当蚕卵转青后将每个卵圈分成两半，分别用纸片包裹，置于高温多湿（28 ℃，95%）条件下孵出蚁蚕，至蚁蚕死亡（5 d）后对其中一半卵圈的所有蚁蚕进行集团检验是否携带有微孢子虫孢子，对另一半卵圈的蚁蚕进行逐头镜检（包括死卵），调查各种微孢子虫对家蚕的胚种传染率（罗梅兰等，2012）。

1. 3. 3 蚕种生产中带毒蚕种胚种传染率调查 跟踪2017年广西桑蚕母种、原原种、原种母蛾的微粒子病检疫数据，收集部分母蛾携带有微孢子虫样本的对应蚕种，分成三大种类：（1）母蛾集团检验含有微孢子虫孢子浓度较高（>10个/视野）的原种；（2）母蛾集团检验含有微孢子虫孢子浓度较低（1～5个/视野）的原种；（3）母蛾单蛾检验含有较高浓度异型微孢子虫的母种和原原种。利用纸片将收集的蚕种分别包裹，在常规条件下催青孵出蚁蚕，再置于高温多湿（28 ℃，95%）条件下至蚁蚕死亡（5 d）。对种类（1）和种类（2）蚕种的蚁蚕采取抽样方式检验，即每张蚕种抽取约200头蚁蚕进行集团检验；对种类（3）蚕种以每个卵圈的所有蚁蚕集团检验方式检验，观察是否携带有微孢子虫孢子，调查蚕种生产中带毒蚕种的微粒子病胚种传染率。

1. 4 异型微孢子虫的系统发育进化分析

1. 4. 1 基因组DNA提取 参照刘吉平等（2004）、罗梅兰等（2012）的方法，采用CTAB法抽提GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等异型微孢子虫基因组DNA。

1. 4. 2 SSU rRNA序列PCR扩增与测序 参照Huang等（2004）、黄旭华等（2012）的方法，选取引物18f（5'-CACCAGGTTGATTCTGCC-3'）和1537r（5'-TTATGATCCTCCTAATGGTTC-3'）对GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等异型微孢子虫的SSU rRNA序列进行PCR扩增，利用凝胶回收目的条带再分别进行克隆。将各微孢子虫的SSU rRNA序列扩增产物送至上海立菲生物技术有限公司进行测序。

1. 4. 3 构建系统发育进化树 参照董世楠等（2009）的方法将测序得到的GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等异型微孢子虫SSU rRNA序列，与GenBank中14种不同种属的微孢子虫进行同源性比对分析，并构建系统发育进化树；同时对各种微孢子虫的SSU rRNA序列进行相似性和遗传距离（分化度）分析。

2 结果与分析

2. 1 广西家蚕病原性微孢子虫分布情况

2. 1. 1 广西蚕区蚕种繁育微孢子虫分布情况 据广西蚕种生产微粒子病检验检疫数据显示，2007～2016年间超过十万张桑蚕原种因感染微孢子虫造成毒率超标而遭淘汰；2007～2016年间在广西蚕区有30家蚕种场生产一代杂交种，也有数十万张蚕种因感染微孢子虫造成毒率超标而遭淘汰。说明广西蚕区蚕种繁育饲养的家蚕受病原性微孢子虫感染严重，每年均有大量蚕种因感染微孢子虫致使检疫结果超标而遭淘汰，即广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛。广西家蚕病原性微孢子虫分布存在以下两个特点：（1）蚕种繁育中出现家蚕病原性微孢子虫感染存在时间和地域差异，如2007～2016年家蚕原种生产毒率呈波动起伏态势，在2009、2011和2015年的毒率处于波峰阶段，由于病原性微孢子虫感染淘汰大量桑蚕原种；且在每年原种生产期间出现上半年毒率较下半年高的现象；另外，在不同地方进行蚕种繁育饲养的家蚕出现病原性微孢子虫感染率存在明显差异，如2008～2009年桂东地区某蚕种场生产的一代杂交种因毒率超标而超过40%的蚕种被淘汰，但在桂北地区的两家蚕种场几乎没有因毒率超标而淘汰蚕种。（2）广西家蚕感染的微孢子虫种类较复杂，除了大部分是典型的卵圆形家蚕微孢子虫外，还有小部分的异型微孢子虫，主要包括长孢子、大孢子和小孢子等种类，且这些异型微孢子虫出现时期较集中，如2011年原种生产有2个批段出现大孢子，2014年百色市蚕种场生产的一代杂交种出现有小孢子，每年均有一些蚕种不同程度地感染长孢子。可见，广西家蚕病原性微孢子虫分布广泛且种类复杂。

2. 1. 2 广西蚕区饲养家蚕微粒子病发生情况 在广西蚕区设点调查家蚕感染微孢子虫的情况，结果发现在柳州市、河池市和贵港市等蚕区抽取的家蚕样品检测出微孢子虫，2016和2017年广西全区收集样品的微孢子虫检出率分别为0.11%和1.87%（表1），表明广西蚕区饲养家蚕存在一定量的病原性微孢子虫感染。

2. 2 异型微孢子虫对家蚕的感染性

2. 2. 1 异型微孢子虫对家蚕的食下感染力 跟踪广西蚕种微粒子病检疫，分离获得GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等11株异型微孢子虫，对比分析这11株异型微孢子虫和N.b对家蚕的食下感染力，结果（表2）表明，各种微孢子虫对家蚕均有一定的感染力，其中，GXM6的感染力较弱，IC50为3.31×106 个/mL；GXM7和GXM13的感染力明显高于N.b，对应的IC50分别是N.b的48.01%和46.51%；其他异型微孢子虫的感染力与N.b相当，均在105个/mL级别。可见，不同家蚕病原性微孢子虫的食下感染力存在一定差异。

2. 2. 2 异型微孢子虫对家蚕的胚种传染率 通过检验各种微孢子虫感染母蛾的后代蚁蚕，发现各种微孢子虫对家蚕的胚种传染率存在明显差异（表3）。在11株异型微孢子虫中，以GXM5对家蚕的胚种传染率最高，达39.28%；而GXM6和GXM13对家蚕不存在胚种传染；其他异型微孢子虫虽然均具有一定的胚种传染率，但其胚种传染率明显低于N.b（51.67%）。说明各种家蚕病原性微孢子虫对家蚕胚种传染存在差异，具有多样性。

2. 2. 3 蚕种生产中带毒蚕种的微孢子虫胚种传染率调查结果 跟踪广西蚕种生产各级亲本的微粒子病检疫情况，发现蚕种中因母蛾携带有不同程度微孢子虫孢子浓度或不同微孢子虫孢子而造成胚种传染存在明显差异。母蛾感染微粒子病越严重，其胚种传染率越高，反之越低，如桑蚕原种中感染微孢子虫严重的蚕种胚种传染率达55.97%（集团检），而母蛾感染程度低的蚕种无胚种传染。此外，感染一些异型微孢子虫的蚕种胚种传染力较低，如桑蚕母种和原原种感染异型微孢子虫的蚕种胚种传染率仅为17.14%（集团检）。

2. 3 异型微孢子虫的分子系统发育规律

经PCR扩增及测序分析，得知GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等异型微孢子虫的SSU rRNA序列长度为1000～1300 bp，符合预期结果。基于微孢子虫SSU rRNA序列构建系统发育进化树，结果发现GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等8株异型微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上（图1）。分析各种异型微孢子虫的相似性和遗传距离（分化度），结果（表4）显示，在8株家蚕病原性微孢子虫中GXM7与GXM9的SSU rRNA序列分化度为0，二者间的相似度为99.8%；GXM3与GXM5的SSU rRNA序列分化度为0.1，二者间的相似度为99.9%；其他微孢子虫间的分化度和相似度则存在明显差异。但GXM7和GXM9、GXM3和GXM5是否属于同一种微孢子虫有待进一步探究分析。此外，与NCBI中已知微孢子虫的对比分析发现，除了GXM5与N.b（D85503）和姬蜂微孢子虫（N. heliothidis，FJ772435）具有较低的分化度（0.1）和较高的相似度（99.9%）外，其他異型微孢子虫与已知微孢子虫间的分化度和相似度存在明显差异，初步证实这些微孢子虫应该是新种类微孢子虫，同时表明广西家蚕病原性微孢子虫在种类上具有丰富的多样性。

3 討论

家蚕是一种应用规模最大的经济昆虫，也是鳞翅目模式昆虫（徐兴耀和刘吉平，2000）。由N.b感染引发的微粒子病具有胚种传染性，蚕业行业法规规定所有蚕种必须经过微粒子病检疫合格才能应用于生产。本研究结合蚕种生产微粒子病检疫工作调查家蚕病原性微孢子虫，以期从分布、感染性和分类特征等方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性。跟踪蚕种生产微粒子病检疫和抽样调查发现，广西蚕区饲养的家蚕在不同时间和不同地域均存在微孢子虫感染情况，每年有大量蚕种因亲本母蛾感染微孢子虫而被淘汰，且蚕种生产毒率呈波动起伏态势，如广西家蚕原种在2009、2011和2015年的毒率处于波峰阶段；此外，不同蚕区饲养家蚕的病原性微孢子虫感染率存在明显差异，说明家蚕病原性微孢子虫分布广泛。

本研究通过测定各种微孢子虫对家蚕的IC50评价其食下感染力，结果显示，感染力最弱的是GXM6（3.31×106 个/mL），感染力最强的是GXM7（8.93×104 个/mL），其他异型微孢子虫的食下感染力与N.b相当，均在105个/mL级别。各种微孢子虫对家蚕的胚种传染力也存在明显差异，总体上表现为N.b对家蚕的胚种传染力最强，平均传染率达51.67%；其他异型微孢子虫的胚种传染力偏低，有些甚至对家蚕没有胚种传染力，如GXM6和GXM13。因此，不同病原性微孢子虫对家蚕的感染力存在明显差异，与郑祥明等（1999）的研究结果一致。基于微孢子虫SSU rRNA序列构建的家蚕病原性微孢子虫系统发育进化树及其相似性和遗传距离分析结果表明，家蚕病原性微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上；分化度和相似度对比分析发现，除GXM7与GXM9、GXM3与GXM5、GXM5与N.b（D85503）和姬蜂微孢子虫（FJ772435）的差异不明显外，其他微孢子虫间的分化度和相似度均存在明显差异，说明广西蚕区存在多种家蚕病原性微孢子虫。

广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛，种类繁多，且各种微孢子虫的感染力存在明显差异，充分证实广西蚕区家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性。今后需对这些微孢子虫的特征进行深入研究，基于微孢子虫的种类、来源和感染力建立完整的家蚕病原性微孢子虫资源数据库，将有助于采取有效措施控制家蚕微粒子病发生，同时有利于筛选出对家蚕、蜜蜂等经济昆虫为非靶标的微孢子虫，为微孢子虫在害虫生物防治中的应用打下坚实基础。

4 结论

广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛，种类繁多，且各种微孢子虫的感染力存在明显差异，即广西家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性。

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（责任编辑 兰宗宝）