卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

侯树鉴　黎江　胡舒　何肇强　 廖永岩　朱鹏　陆专灵　韦友传

摘要：【目的】明確卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因（TroCatL）的遗传进化规律及其组织表达水平，为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据。【方法】应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA，采用生物信息学方法对其序列特征进行分析；并以实时荧光定量PCR（qPCR）检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性。【结果】TroCatL基因全长cDNA为1492 bp（GenBank登录号MH036350），包括开放阅读框（ORF）1011 bp、5'端非翻译区（5'-UTR）120 bp和3'端非翻译区（3'-UTR）361 bp。TroCatL基因编码336个氨基酸残基，其理论等电点（pI）5.7，预测分子质量37.93 kD，且存在CatL特有的保守结构域（ERFNIN、GNFD和GCXGG基序）及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点。TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%～95.2%，尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近。TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达，以在肝脏中的表达最高，在脑组织中的表达最低。经溶藻弧菌感染后，TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调，肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值，血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值。【结论】TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守，通过参与机体的免疫应答反应，在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色。

关键词： 卵形鲳鲹；组织蛋白酶L（CatL）；溶藻弧菌；克隆；表达分析

中图分类号： S965.331 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）06-1215-08

Abstract：【Objective】The aim of the study was to definite genetic evolution rule and tissue expression level of cathepsin L gene in Trachinotus ovatus（TroCatL）， provide theoretical basis for researching biological function and disease resistant mechanism of CatL. 【Method】The full length cDNA sequence of TroCatL were cloned by using RT-PCR and RACE technology， and the sequence features were analyzed by using bioinformatics methods. Real-time fluorescence quantitative PCR（qPCR） was used to detect the expression of TroCatL gene in healthy tissues and its correlation with Vibrio alginolyticus infection. 【Result】The full length of TroCatL cDNA was 1492 bp（GenBank accession number：MH036350）， including a 1011 bp open reading frame（ORF）， a 120 bp 5' untranslated region（5'-UTR） and a 361 bp 3' untranslated region（3'-UTR）. The TroCatL gene encoding 336 amino acid residues with theoretical isoelectric point（pI） of 5.7 and predicted molecular weight of 37.93 kD. It contained conservative domain structure（ERFNIN， GNFD and GCXGG motifs）， and a cysteine protease active site formed by 139Cys， 279His and 303Asn. The amino acid sequences of TroCatL shared 83.9%-95.2% homology with CatL amino acids of other fish species， especially sharing the closest relative relationship with Seriola dumerili. TroCatL mRNA were expressed in all detected tissues from healthy T. ovatus while the highest level was in liver and the lowest was in brain. TroCatL mRNA were significantly up-regulated in liver， spleen and blood after being infected by V. alginolyticus. TroCatL mRNA in liver and spleen reached the peak value 24 h post infection， while that in blood reached the peak value 12 h post infection. 【Conclusion】TroCatL protein domains and catalytic active sites are evolutionarily conserved in T. ovatus， and play an important role in against of bacteria or virus infection by participating in host immune response.

Key words： Trachinotus ovatus； cathepsin L（CatL）； Vibrio alginolyticus； clone； expression analysis

0 引言

【研究意义】组织蛋白酶L（Cathepsin L，CatL）是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成员，是一种重要的溶酶体半胱氨酸蛋白内肽酶，广泛存在于动植物体内，具有蛋白水解酶活性（Barrett and Rawlings，2001；杨东辉等，2012）。CatL是以无活性的前体酶原形式存在，在酸性环境下，经自我剪切或其他蛋白酶加工形成正确的空间结构后活化（Lowther et al.，2009）。CatL在生物体中发挥重要作用，主要参与机体抗原加工（Luziga et al.，2016）、抗原提呈（Shen et al.，2015）、肿瘤入侵和转移（Wang et al.，2018）、個体发育及组织分化等多种生理和病理过程。因此，对CatL进行深入研究可为鱼类病害免疫防治及品种选育提供科学依据。【前人研究进展】哺乳类动物的CatL通过降解及细胞内吞作用获得外源性蛋白，产生抗原决定簇，并通过促进MHCⅡ分子成熟而参与抗原提呈过程（Honey et al.，2002）。当细胞被某些理化因子刺激后，CatL从溶酶体中释放到胞浆并活化，通过线粒体途径引起细胞色素C释放，进而引起Caspase途径的细胞凋亡（Cirman et al.，2004）。如寄生虫类CatL能抑制宿主的免疫应答及诱导免疫耐受反应，从而逃避宿主对自身的清除作用（Sajid and McKerrow，2002）。在无脊椎动物及硬骨鱼类的细胞分裂过程中，CatL抑制剂Ⅰ能阻止染色体解凝，进而影响细胞分裂（Morin et al.，2008）。目前，多种水产动物的CatL基因已被克隆鉴定，如泥鳅（Misgurnus mizolepis）（Ahn et al.，2010）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）（Li et al.，2010）、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）（Aroc-kiaraj et al.，2013）、脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）（段亚飞等，2013）和罗非鱼（Oreochromis niloticus）（Liang et al.，2017）等，普遍认为CatL基因与鱼类的免疫功能有关，尤其在先天性免疫调控中发挥重要作用。因此，加强对CatL基因的深入研究可为鱼类病害免疫防治提供新思路。【本研究切入点】近年来，随着卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）养殖规模的逐年扩大，其养殖环境日趋恶化，病害频繁发生（夏立群等，2012；黄婷等，2014），给其养殖业带来巨大经济损失，但至今鲜见有关卵形鲳鲹CatL基因（TroCatL）的研究报道。【拟解决的关键问题】应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA，采用生物信息学方法对其特征进行分析，研究其遗传进化规律，并以实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）检测TroCatL基因在健康卵形鲳鲹组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染的关联性，为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试卵形鲳鲹（256.64±45.56 g/尾）购自广西北海市铁山港区石头埠丰顺养殖有限公司，溶藻弧菌和大肠杆菌TOP10感受态细胞由广西大学动物科学技术学院水产教研室保存提供，Trizol试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）购自MBI Fermentas公司，SMART RACE cDNA Amplification Kit、pMD18-T和SYBR? Green PreMix Ex Taq购自TaKaRa公司。

1. 2 引物设计与合成

参考GenBank中鱼类CatL基因的同源序列及TroCatL基因cDNA序列，使用Oligo 6.0设计扩增中间片断引物、RACE引物及qPCR引物（表1）。上述引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 TroCatL基因全长cDNA克隆

1. 3. 1 TroCatL基因中间片段扩增 总RNA提取参照Trizol试剂说明进行操作，经DNase I处理后采用逆转录试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）合成cDNA，再以巢氏PCR扩增cDNA中间片段。（1）第一轮PCR反应体系：cDNA模板1.00 ?L，10×Buffer 2.50 ?L，dNTP Mix（10 mmol/L）0.25 ?L，外引物TroCatL-F1和TroCatL-R1各1.00 ?L，Taq DNA聚合酶1.00 ?L，ddH2O补足至25.00 ?L。（2）第二轮PCR反应体系：以第一轮PCR产物稀释50倍后为模板，引物为内引物TroCatL-F2和TroCatL-R2，其他成分与第一轮PCR相同。两轮PCR扩增程序相同：94 ℃预变性4 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行5个循环；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行5个循环；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行20 个循环；最后72 ℃延伸10 min。第二轮PCR产物经电泳检测、胶回收后与pMD18-T载体连接，转化TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1. 3. 2 TroCatL基因cDNA末端扩增 以卵形鲳鲹脾脏组织总RNA为模板，参照SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒说明合成TroCatL基因5'和3'-SMART cDNA。5' cDNA末端扩增以5' SMART cDNA为模板（0.50 ?L），加入外引物TroCatL-5R1和UPM（5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCA

GTGGTATCAACGCAGAGT-3'）各1.00 ?L，Taq DNA聚合酶1.00 ?L，ddH2O补足至25.00 ?L。第二轮PCR以第一轮PCR产物稀释50倍后为模板，引物为TroCatL-5R2和NUP（5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAG

AGT-3'），其他成分与第一轮PCR相同。扩增程序与1.3.1同。同理，扩增3' cDNA末端。5'和3' cDNA末端扩增产物的处理与中间片段同。

1. 4 TroCatL基因序列特征及同源性分析

采用SeqMan拼接TroCatL基因cDNA全长序列，以ExPASy网站（http：//expasy.org/tool）的相关在线软件预测TroCatL基因开放阅读框（Open reading frame，ORF）、蛋白分子量及其推导编码氨基酸序列；应用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel. expasy.org）进行蛋白结构域预测，利用SignalP 4.1进行信号肽预测。从NCBI数据库收集其他物种的CatL基因同源序列，采用ClustalX 1.83和MEGA 5.0进行聚类分析，并构建系统发育进化树。

1. 5 TroCatL基因mRNA表达分析

卵形鲳鲹暂养于实验室水族箱内，保持盐度20‰～30‰，水温18～32 ℃、pH 7～9，溶解氧在5 mg/L以上，全天充气增氧，每天投喂卵形鲳鲹商品饲料1次。暂养7 d后，随机挑选5尾卵形鲳鲹，麻醉后分别采集脑、鳃、胃、肠、头肾、肝脏、心脏、血液、脾脏和肌肉等组织样品，-80 ℃保存备用或直接用于提取总RNA，分析TroCatL基因在健康鱼体组织中的表达分布。同时，将卵形鲳鲹随机分为试验组和对照组，试验组每尾腹腔注射0.1 mL的5×106 CFU/mL溶藻弧菌悬液，对照组注射等量的灭菌PBS，于攻毒后不同时间点（0、4、8、12、24、48和72 h）麻醉采集肝脏、脾脏和血液样品，用于分析溶藻弧菌感染与TroCatL基因表达变化规律。其中，qPCR以β-Actin为内参基因，反应体系20.00 ?L：cDNA模板2.00 ?L，SYBR? Green PreMix Ex TaqTMⅡ 10.00 ?L，上、下游引物（QCatL-F1、QCatL-R1或β-ActinF1、β-ActinR1）各0.30 ?L，ddH2O补足至20.00 ?L。扩增程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃ 10 s，64 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，进行40个循环，每次延伸后荧光读板；最后72 ℃延伸3 min。每个样品均重復3次，参照韦友传等（2011）的方法对TroCatL基因mRNA表达进行相对定量分析。

2 结果与分析

2. 1 TroCatL基因克隆与序列拼接效果

将RT-PCR和RACE扩增产物（中间片段、5'和3' cDNA末端）进行凝胶电泳检测（图1），胶回收后与pMD18-T载体连接，并转化TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序，测序结果显示，TroCatL基因的中间片段、5'和3' cDNA末端序列分别为692、495和531 bp。将中间片段与5'和3' cDNA末端序列拼接，获得TroCatL基因全长cDNA为1492 bp（GenBank登录号MH036350）。

2. 2 TroCatL基因cDNA全长序列特征分析结果

采用ExPASy网站相关在线软件对TroCatL基因cDNA全长序列进行分析，结果（图2）表明，TroCatL基因ORF为1011 bp，5'端和3'端非翻译区（Untransla-ted region，UTR）分别为120和361 bp，在3'-UTR发现有poly（A）尾。TroCatL蛋白信号肽预测结果表明，其蛋白信号肽序列位于氨基酸序列的第1～17位，信号肽序列为MLPVAVLAACLTAVLSA（图3）。氨基酸序列分析结果表明，TroCatL基因编码336个氨基酸残基，理论等电点（pI）5.7，预测分子质量37.93 kD，且存在CatL特有的保守结构域ERFNIN[E-X3-R-X2-（I/V）-F-X3-N-X3-I-X3-N]、GNFD和GCXGG基序。TroCatL蛋白氨基酸序列还存在CatL特有的氧离子洞（133Gln）及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点。采用SWISS-MODEL对TroCatL蛋白三级结构进行预测，结果发现ERFNIN基序位于同一个α-螺旋结构中（图4）。

2. 3 TroCatL基因系统发育进化分析结果

为探索TroCatL基因的遗传进化规律，将其与其他32个物种同源基因编码的氨基酸序列进行同源性比对分析，结果（表2）显示，TroCatL氨基酸序列与哺乳类物种CatL氨基酸序列的同源性为61.1%～68.1%，与鸟类的同源性为78.3%～81.5%，与两栖类的同源性为79.1%～79.5%，与其他鱼类的同源性高达83.9%～95.2%。与其他鱼类CatL氨基酸序列同源性比对分析发现，同源性最高的是鰤鱼（Seriola dume-rili）（95.2%），最低的是虹鳟（Oncorhynchus mykiss）（83.9%）。基于CatL氨基酸序列构建系统发育进化树，结果发现可划分为哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类4个分支，其中卵形鲳鲹与其他鱼类聚为一支，尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近（图5）。

2. 4 TroCatL基因mRNA的组织表达水平分析结果

qPCR检测TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹各组织中的表达情况，结果表明，TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹的10个组织中均有表达（图6）。其中，在脑组织中的表达量最低（设定为1），在肝脏中的表达量最高。TroCatL基因mRNA的组织表达水平排序为：肝脏>脾脏>头肾>肠道>鳃>血液>心脏>胃>肌肉>脑。

2. 5 溶藻弧菌感染后TroCatL基因mRNA的表达变化规律

TroCatL基因mRNA表达变化与溶藻弧菌感染的关联性表现为：攻毒4 h后，TroCatL基因mRNA在脾脏和肝脏中的表达均显著上调（P<0.05，下同），但在血液中的上调表达水平不显著（P>0.05）；至攻毒24 h时，TroCatL基因mRNA在脾脏和肝脏中的表达水平达峰值，极显著高于攻毒前的表达水平（P<0.01）；此后TroCatL基因mRNA在各组织的表达水平呈下降趋势，至攻毒72 h时，其表达量明显低于攻毒24 h后的表达量，但仍显著高于攻毒前的表达水平（图7）。

3 讨论

CatL作为溶酶体中的一种重要半胱氨酸蛋白酶，其蛋白结构存在典型的保守结构域（ERFNIN、GNFD和GCXGG基序），其中，ERFNIN基序与蛋白水解酶活性的抑制相关（石晓燕等，2003），GNFD基序与CatL蛋白的前体折叠相关（鄢荣歆等，2009），GCXGG基序参与CatL蛋白二硫键的形成（白志毅等，2011）。此外，存在半胱氨酸蛋白酶保守活性位点（催化三联体），通过催化蛋白水解而参与机体的诸多生理调节过程。本研究利用RACE技术首次从卵形鲳鲹克隆获得CatL基因，其cDNA全长1492 bp，ORF为1011 bp，编码336个氨基酸残基；氨基酸序列分析发现，TroCatL蛋白同时存在ERFNIN、GNFD、GCXGG基序及典型的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点（催化三联体），其中ERFNIN基序中的ERNIN高度保守，仅Phe（F）被Trp（W）替换，与在合浦珠母贝（麻建军等，2010）和红鳍东方鲀（梁静真等，2012）上的研究结果一致；TroCatL蛋白GCXGC基序的X为Asn（N），与多数水产物种如脊尾白虾（段亚飞等，2013）的位点一致。TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%～95.2%，其中与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近。

CatL在机体抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色。Arockiaraj等（2013）研究发现，以嗜水气单胞菌感染罗氏沼虾后，其血细胞中的CatL基因上调表达，说明CatL参与机体先天性免疫反应。段亚飞等（2013）研究发现，注射感染鳗弧菌和白斑综合症病毒后，脊尾白虾血细胞中的CatL基因表达量在12 h内达最大值，说明CatL是一种参与机体免疫反应的重要因子。潘光照等（2017）研究表明，以大肠杆菌刺激家蚕幼虫能显著上调CatL基因的表达水平，故推测CatL参与家蚕免疫反应。本研究结果表明，TroCatL基因可在健康卵形鲳鲹的多种组织中表达，其中以肝脏的表达量最高。以溶藻弧菌感染卵形鲳鲹后，其肝脏、脾脏和血液中的TroCatL基因表达水平均上调，肝脏和脾脏中的TroCatL基因在攻毒后24 h达峰值，血液中的TroCatL基因在感染后12 h达最高值，因此推测TroCatL也参与机体免疫反应。

4 结论

TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守，通过参与机体的免疫应答反应，在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色。

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（責任编辑 兰宗宝）