银杏bHLH91转录因子基因的克隆及表达分析

何昌文 朱丽 沈珊 张威威

摘 要： bHLH转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和次生代谢中具有重要的调控作用。该研究通过PCR技术从银杏（Ginkgo biloba）叶中分离得到了一个bHLH基因的cDNA序列，并将其命名为GbbHLH91。序列分析结果显示扩增的GbbHLH91基因cDNA序列长度为1 425 bp，开放阅读框是1 065 bp，编码354个氨基酸，分子量为 40.1 kDa，等电点为8.20。系统进化分析结果显示，从用于进化树构建的bHLH蛋白质聚类情况来看，银杏GbbHLH91蛋白与裸子植物油松（Pinus tabuliformis）bHLH蛋白親缘关系最近，且与被子植物无油樟（Amborella trichopoda）bHLH蛋白相似性达到60%，表明该基因在进化过程中相对比较保守。实时荧光定量PCR分析发现银杏bHLH91基因在银杏的各个组织中均有表达，其中在银杏叶中表达量最高，在根和茎中基因的表达量次之，在银杏雌花和果中表达量较少，在雄花中的表达水平最低；GbbHLH91基因在不同发育时期的银杏叶片中，表达量也存在一定的差异，其中在4月中旬该基因的表达水平达到最高，而后随着叶片的生长发育，该基因的表达水平呈现下降趋势。该研究结果为进一步验证GbbHLH91基因的功能奠定了前期基础。

关键词： 银杏， bHLH， 转录因子， 基因克隆， 表达分析

中图分类号： Q943.2

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2018）02-0202-08

Cloning and expression analysis of a bHLH91 transcription factor gene from Ginkgo biloba

HE Changwen1， ZHU Li2， SHEN Shan2， ZHANG Weiwei2*

（ 1. Jingzhou Branch， Hubei Academy of Forestry Sciences， Jingzhou 434020， Hubei， China； 2. College of Horticulture and Gardening， Yangtze University， Jingzhou 435025， Hubei， China ）

Abstract： bHLH transcription factor plays an important role in plant growth， stress response and secondary metabolism. In order to study the function of bHLH transcription factor gene in Ginkgo biloba， we isolated a bHLH gene from G. biloba and carried out bioinformatics and expression analyses. In this study， a cDNA sequence of bHLH gene was isolated from G. biloba by PCR， which was designated as GbbHLH91. DNA sequencing and sequence analysis showed that the amplified GbbHLH91 gene was 1 425 bp， GbbHLH91 gene contained a complete open reading frame， and the open reading frame of GbbHLH91 was 1 065 bp， encoding 354 amino acids. The predicted GbbHLH91 protein had a molecular mass of 40.1 kDa with isoelectric point value of 8.20. Homology analysis with BLASTP and Align X indicated that the putative GbbHLH91 share a high identical with other known bHLH proteins from different plant species. Phylogenetic analysis showed that the GbbHLH91 protein was closely related to bHLH protein from Pinus tabuliformis， and was 60% identity to bHLH from Amborella trichopoda， which indicated the bHLH gene was relatively conserved during evolution. Real-time PCR assay found that GbbHLH91 gene was expressed in all tested tissues of Ginkgo biloba， while expression level in leaf was the highest， followed by root and stem， the GbbHLH91 gene was lowly expressed in female flowers and fruits of G. biloba， and the lowest in male flower. The expression level of GbbHLH91 gene in G. biloba leaves at different developmental stages was also different. The expression level of GbbHLH91 gene was the highest in mid-April， and then the expression level of the gene showed a decreasing trend with the growth and development of G. biloba leaves. These results provide a preliminary basis for further validation of the GbbHLH91 gene function.

Key words： Ginkgo biloba， bHLH， transcription factors， gene clone， express analysis

银杏（Ginkgo biloba）是一种十分古老的珍贵树种，享有植物界 “活化石”的美誉，银杏用途广泛，具有重要的观赏、经济和药用等价值。银杏叶活性成分主要是类黄酮和萜内酯。类黄酮作为植物次生代谢主要成分之一，在植物体内具有保护植物免受紫外线损伤（Harborne & Williams， 2000）、调节植物的花色或果实颜色（Lepiniec et al， 2006）、调节生长素运输和防御病原体和昆虫（Dixon et al， 2005），以及响应外界胁迫等功能（Cominelli et al， 2005）。银杏类黄酮是预防治疗早期阿尔茨海默病，心血管疾病和癌症等疾病的有效药用成分（Diamond et al， 2000）。银杏也是一种童期特别长的中生代孑遗裸子植物，一般实生苗种植15～20 a才能开花结果，这给银杏优良品种的选育带来了严重的影响。

bHLH（basic Helix-Loop-Helix）转录因子构成了真核生物蛋白质中的一个大家族，其成员在生物的生长发育调控过程中起着极为重要的作用（王勇等，2008）。bHLH蛋白在动物中有6大类 （A-F），其中A类含有20个家族，B-F分别含有12、7、1、3、1个家族（Ledent & Vervoort， 2001）；植物中的bHLH蛋白大多属于B组，系统发育分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、白杨（Populus tomentosa）、苔藓（Bryophyta）及藻类（Algae）的bHLH转录因子，可以将这些植物的bHLH基因细分为32个亚家族（Carreteropaulet et al， 2010）。bHLH转录因子在不同的植物组织中广泛存在，可参与植物的生长发育、胁迫应答以及植物的次生代谢等。例如，在拟南芥中，编码bHLH蛋白质的雄性不育基因DYT1能够在绒毡层中高水平表达，控制绒毡层的分化和发育（Zhang et al， 2006）；在许多植物中，bHLH转录因子也可以上调次生代谢途径中酶基因的表达，调控植物中类黄酮、生物碱、萜类等活性成分生物合成（张鑫等，2014）。bHLH参与调控类黄酮代谢往往和其他转录因子如MYB，WDR等形成复合物来实现（Nakatsuka et al， 2008）。bHLH转录因子在植物体内也可以响应外界生物胁，将葡萄VvbHLH1转入拟南芥中表达，能够促进类黄酮的积累和ABA信号传递，从而提高拟南芥对盐和干旱的抵抗力（Wang et al， 2016）。bHLH转录因子是蛋白质的一个超级大家族，其在不同植物体内的分子机制尚未研究清楚。

目前，有关bHLH转录因子的功能研究在银杏上尚未见报道。本研究以银杏为试材，首次通过PCR技术从银杏叶中分离出目的基因GbbHLH91，分析了该转录因子结构特点，以及GbbHLH91基因在银杏各组织、银杏叶不同发育时期中的表达水平，为后期验证生物学功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

用于试验的30年生银杏种植于长江大学西校区校园，水肥管理条件相同，长势一致。随机选取1株银杏树进行样品采集，在4月中旬，采集用于不同部位分析的根、茎、叶、雄花、雌花，在5月中旬，采集果实；在4月初到7月中旬采集用于不同时间表达分析的银杏叶片，每两周采集一次。样品采集过程中带一次性手套和口罩。采集后立即在液氮中速冻，带回实验室并保存在-80 ℃冰箱中用于后续RNA的提取实验。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 将采集的银杏各组织样品在液氮中碾成粉末状，参照Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa， MiniBEST）试剂盒说明书提取各组织总RNA。通过使用分光光度计在OD260/280吸光值和1%（w/v）琼脂凝胶电泳，检测总RNA的质量、浓度和纯度。

1.2.2 GbbHLH91基因cDNA合成与克隆测序 采用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，大连）试剂盒把提取的银杏RNA反转录得到cDNA。根据课题组前期测序得到的银杏转录组数据，设计bHLH基因特异引物，送往上海生工合成。上游引物GbbHLHF为5′-GCAGCAGCAGCAACAACAACAACAT-3′，下游引物GbbHLHR为5′-TATTGCTCTAAAAAACCTTTAAGGGACG-3′。以cDNA为模板扩增银杏bHLH基因。PCR反应体系50 μL：包括ddH2O 40.5 μL，10×Buffer（Mg2+）5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，Taq DNA polymerase（5 U·μL-1）0.5 μL。PCR擴增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃、30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共32个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃结束。PCR扩增产物经1%凝胶电泳检测，利用凝胶回收试剂盒切胶回收预期目的基因产物，纯化后连接到pMD18-T（TaKaRa，大连）载体上，并转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，转化后的菌液均匀涂抹在平板上进行蓝白斑筛选，挑选白色菌落做菌液PCR，将检测含有目的基因的菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.3 生物信息学分析 利用在线生物信息学工具blastx和blastp（NCBI， http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），对PCR扩增的核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对。使用Vector NTI Suite v11.5和DNAMAN 8来分析GbbHLH91基因的cDNA序列，进行ORF的查找和蛋白质的翻译。利用在线工具ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）对GbbHLH91氨基酸的分子量、等电点等理化学性质进行分析。利用软件Align X（Vector NTI Suite V 11.5）对多种植物的bHLH蛋白质进行多重比对分析；在用Clustal X 2.0软件进行多重序列比对的基础上，借助MEGA 6.0软件采用邻接法（Neighbor-joining）构建系统进化树，使用Bootstrap对系统树可信性进行检验，重复1 000次。

1.2.4 实时荧光定量PCR分析 使用Plant RNA Extraction Kit（TaKaRa， MiniBEST）试剂盒分别提取银杏根、茎、叶、雄花、雌花、果的总RNA，以及不同发育时期叶片的总RNA。按照试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser说明书把提取的RNA反转录成cDNA。根据GbbHLH91的cDNA序列设计实时荧光定量引物，上游引物GbbHLHRTS为5′-CGTGAAGGTGCCTTGGCTGAT-3′，下游引物GbbHLHRTA为5′-TGCGACGTTTCCTTTGAATGAGT-3′。qRT-PCR内参基因选用的是GAPDH，其上游引物序列GAPDH-F：5′-CTGGCGTAGAGTATGTGGTTGAAT-3′，下游引物序列GAPDH-R：5′-CACGCCAACAACGAACATG-3′。实时荧光定量PCR在Bio-Rad公司的PCR仪Mini OpticonTM Real-Time PCR system上进行，用SYBR Green荧光染料法进行实时定量表达分析，具体操作步骤参照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TliRNase H Plus）试剂盒说明书。每种实验样品进行定量PCR扩增时均进行三次技术重复，bHLH91和内参基因GAPDH以三次重复的cDNA为模板进行定量PCR扩增，并分别设置一个阴性对照（模板为ddH2O）。反应程序为95 ℃、30 s，95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，共40个循环。用Microsoft Excel 2013分析输出结果，采用2-△△Ct法计算GbbHLH91基因相对表达水平。

2 结果与分析

2.1 GbbHLH91基因全长cDNA克隆和序列分析

利用试剂盒提取银杏叶总RNA，其OD260/280吸光值在1.8～2.1之间，琼脂糖凝胶电泳检测显示质量较好（图 1），可用于反转录实验。利用GbbHLH基因特异性引物，从反转录获得的银杏cDNA中PCR扩增得到一条GbbHLH基因序列。经NCBI网站的Blastx在线程序比对分析显示该cDNA序列与无油樟的bHLH91序列具有60%相似性；在转录因子数据库中PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/） 运行Blast工具比对拟南芥转录因子数据库，比对结果为拟南芥bHLH转录因子家族的bHLH91。两次比对结果表明从银杏中克隆的bHLH基因应为bHLH91基因，因此命名为GbbHLH91。该序列长度为1 425 bp，包含1 065 bp的开放阅读框，编码354个氨基酸（图 2）。

2.2 银杏GbbHLH91编码蛋白质特征性分析

GbbHLH91基因编码354个氨基酸，在线工具ExPASy分析结果显示，GbbHLH91基因编码的蛋白质分子量为 40.1 kDa，等电点为8.20。蛋白质序列同源比对分析借助在线工具BLASTP（NCBI）和Align X（Vetctor NTI 11.5）完成。同源比对结果发现，GbbHLH91蛋白质与其他植物的bHLH蛋白质具有一定的相似性（图 3）。其中，和无油樟（Amborella trichopoda， XP_006854151）、油松（Pinus tabuliformis， AJP_06244）、陆地棉（Gossypium hirsutum， XP_016753830）、可可（Thebroma cacao， EOY17565）、核桃（Juglans regia， EOY17565）、葡萄（Vitis vinifera， CAN77001）、蓖麻（Ricinus communis，XP_008347044）、苹果（Malus domestic， XP_002534354）的bHLH蛋白质之间的一致性分别为60%、51%、51%、52%、51%、52%、50%、50%。比对结果显示银杏GbbHLH91与其它植物的bHLH蛋白质具有共同的保守域Helix-Loop-Helix，表明银杏GbbHLH91属于bHLH转录因子家族成员。

2.3 GbbHLH91基因系统进化分析

为了研究GbbHLH91基因的系统进化，本研究選取来自不同科属的10个物种的bHLH氨基酸序列，利用软件ClustalX 2.0和MEGA 6.0通过邻接法（Neighbor-joining）构建了系统进化树。系统进化树结果显示，进化树分为裸子植物、被子植物门两大分支（图 4）。其中，银杏GbbHLH91与同为裸子植物的松科植物油松（Pinus tabuliformis， AJP_06244）bHLH聚类在一个分支，表明在这些用于进化树构建的蛋白质中，二者亲缘关系相对更近。单子叶植物禾本科的玉米（Zea May， NP_001149299）、水稻（Oryza brachyantha， AAO00687）、节节麦（Aegilops tausc， EMT07628）亲缘关系相对较近，聚类在同一个进化分支上；而双子叶植物，如大戟科的麻风树（Jatropha curcas， XP_012065727）、蓖麻（Ricinus communis， XP_002534354），蔷薇科的苹果（Malus domestic， XP_008347044）、白梨（Pyrus bretschneideri， XP_009373855），豆科的野生大豆（Glycine soja， KHN25939）、蒺藜苜宿（Medicago truncatula， XP_013457399）聚在另一大类。这些结果表明在基因的进化中，同科植物的bHLH基因进化关系较近，与植物本身之间的亲缘关系一致，表明bHLH基因在进化过程中比较保守。

2.4 GbbHLH91基因的表达分析

利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）测定了银杏各组织和不同发育时期银杏叶中GbbHLH91基因的表达水平。结果表明，GbbHLH91基因在银杏各个组织中都有表达（图5：A），其中GbbHLH91基因在银杏叶中表达量最高， 根中表达量次之，在雄花、雌花和果中表达量较低，该结果说明GbbHLH91基因在银杏各个组织中的表达量具有较大的差异性。GbbHLH91基因在不同发育时期的银杏叶片中表达量也有差异（图5：B），其中GbbHLH91基因的表达量在4月、5月表达量较高，并在4月中旬达到最大值，而后表达水平呈现逐渐下降趋势。GbbHLH91基因表达量的差异可能与该蛋白质在银杏中的分子功能有关。

3 讨论与结论

bHLH转录因子是植物中的一大重要转录因子家族。本研究从银杏中分离得到了GbbHLH91转录因子基因。前期研究表明，bHLH基因在植物体内可参与植物的生长发育、胁迫应答和次生代谢。目前，有关bHLH91转录因子的研究报道较少，拟南芥bHLH091在花药中大量表达，可以与 bHLH010、bHLH089 结合，一起参与拟南芥花药的生长发育（Zhu et al， 2015）。bHLH010/bHLH089/bHLH091主要通过与DYT1相互作用的反馈调节来调控拟南芥花药的发育转录过程（Cui et al， 2016）。与拟南芥bHLH091基因的表达模式不同，本研究中，GbbHLH91基因在雄花中的表达量最低，而在叶中、茎中表达量相对较高。在不同发育时期的银杏叶中，4月该基因的表达量较高，而此时也是银杏雄花的发育时期。银杏是童期非常长的一种植物，其开花调控机制可能存在着物种的特异性，推测bHLH91基因在银杏和拟南芥中的具体调控功能或者调控方式可能不同。Bai et al（2011）研究发现，烟草bHLH基因NtAn1a和NtAn1b的异位表达能显著提高烟草中花青素含量。在本研究中，GbbHLH91基因在银杏的叶片中表达量最高，雄花中最低。另外，相对于其他组织而言，黄酮类化合物在银杏叶中含量最高（高丽雅等，2007）；因此，GbbHLH91基因在银杏叶片中表达量最高，推测该基因在银杏中也可能与類黄酮的代谢合成有关。转录因子在植物抵抗逆境胁迫信号传导过程中发挥着重要的作用。研究发现，一些植物bHLH转录因子不但参与植物的次生代谢，同时还参与响应植物的非生物胁迫。比如拟南芥AtbHLH61/93/122（Zhao et al， 2013； Liu et al， 2014）转录因子、水稻OrbHLH2（Zhou et al， 2009）、水稻 OsbHLH148（Seo et al， 2011）转录因子等。在刚毛柽柳中，ThbHLH1转录因子可以提高胁迫相关基因的表达从而来提高植物的抗性（Ji et al， 2016）。苦荞FtbHLH3基因在拟南芥中表达，可以通过ABA信号途径提高拟南芥抵御干旱胁迫的能力（Yao et al， 2017）。GbbHLH91基因在银杏叶片、根中表达量较高，推测GbbHLH91转录因子可能在银杏根部也参与响应了外界逆境胁迫。

总之，本研究克隆获得了银杏一个GbbHLH91转录因子基因，对该转录因子结构特点进行了分析；并分析了GbbHLH91基因在银杏不同组织、不同发育时期银杏叶中的表达情况，为进一步弄清GbbHLH91转录基因在银杏中的调控功能奠定了基础。

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