沙柑花粉形态观察研究

唐艳 武晓晓 邓崇岭 刘冰浩 陈传武 牛英

摘 要： 該研究以沙柑（Citrus nobilis）以及其他的柑橘类共22个品种的花粉为材料，通过FEI Quanta 200场发射环境扫描电镜观察花粉的赤道面、极面、外壁纹饰等形态特征，并对沙柑的分类地位及亲缘关系进行了分析。结果表明：沙柑花粉为中等型、形状为长球形，存在4条孔沟，极轴长为（29.98 ± 1.18） μm，赤道轴长为（22.32 ± 1.03） μm；外壁纹饰为网状纹饰，网眼为圆形或者近圆形，网眼直径大小为（0.89 ± 0.10） μm，网脊平宽光滑不隆起，网脊宽度为（0.62 ± 0.07） μm。经过花粉形态比较并进行聚类分析，结果显示沙柑应为杂种起源，且与扁柑、年橘、广西红皮酸橘的花粉特征较为接近，在遗传距离0.442处聚为一组，推测四者具有一定的亲缘关系，且沙柑与后三者相比可能较为原始；沙柑与岑溪酸橘、印度酸橘、姑婆山野生元橘、贺州野橘等可能存在一定的亲缘关系但亲缘关系较远，可结合分子标记等技术进行更深层次的研究。该研究结果为沙柑遗传演化、分类地位以及亲缘关系的鉴定提供了依据。

关键词： 沙柑， 花粉， 形态， 亲缘关系， 演化

中图分类号： Q944.58

文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2018）02-0250-10

Preliminary observation on pollen morphology of Shagan （Citrus nobilis）

TANG Yan1， WU Xiaoxiao1，2， DENG Chongling1*， LIU Binghao1， CHEN Chuanwu1， NIU Ying1

（ 1. Guangxi Key Laboratory of Citrus Biology， Guangxi Academy of Specialty Crops， Guilin 541004， Guangxi， China； 2. College of Life Sciences， Guangxi Normal University， Guilin 541004， Guangxi， China ）

Abstract： Pollen morphology has a certain conservatism， so it is often used as a classification basis for plant resources. The observation of citrus pollen morphology can provide some references for citrus classification. The pollen of Shagan（Citrus nobilis） and other citrus material was observed by FEI Quanta 200 field emission scanning electron microscopy. The morphological characteristics of pollen equatorial view， polar view and exine ornamentation were analyzed by the SPSS and NTsys software. And their genetic relationship was analyzed. The results showed that the pollen of C. nobilis is 4-colpate type and it had round or roughly round pollen mesh. The pollen of equatorial axis of C. nobilis was （29.98 ± 1.18） μm， the polar axis was （22.32 ± 1.03） μm， the mesh ridge was （0.62 ± 0.07） μm； and the mesh size was （0.89 ± 0.10） μm. The pollen morphology was compared with the results of cluster analysis. The results showed that the C. nobilis should be the origin of hybrids. The pollen characteristics of Biangan， Nianju， Guangxihongpisuanju and C. nobilis were similar， and the genetic distance was 0.442， which suggested that the four had a certain genetic relationship， and C. nobilis may be more primitive. There are some phylogenetic relationships in the world， such as Cenxisuanju， Yindusuanju， Guposhanyeshengyuanju and Hezhouyeju， which can be further studied with molecular markers. This study provides information for genetic evolution， taxonomic status and relative relationship of C. nobilis.

Key words： Shagan（Citrus nobilis）， pollen， morphology， relative relationships， evolution

沙柑，别名广西沙柑、大沙柑、柑宏（“大柑”的意思），原产中国广西及越南。在中国主要分布于广西都安、邕安、上思、靖西、宜山等市县，栽培历史较长，是广西西南部的地方品种。沙柑在柑橘分类学上地位显著，通常作为芸香科（Rutaceae）柑橘亚科（Aurantioideae）柑橘族（Citreae）柑橘亚族（Citrinae）柑橘属（Citrus L.）真正柑橘亚属（subgenus Eucitrus）宽皮柑橘区（C. reticulata Blanco）柑亚区（Mandarin）中代表种之一。曾勉（1960）提出的柑橘分类系统中将沙柑[（S. Nobilis （Lauriro） Tseng]定为一个种，并认为可能是杂交种；Singh & Nath（1970）在第一届国际柑橘会议上提出《实用柑橘分类的方法》将王柑（Citrus nobilis）定为一个种；蒋聪强（1983）提出的“柑桔三属左右线分类系统”也将沙柑（Citrus nobilis Lour）定为一个种；《中国果树志·柑橘卷》在柑亚区记录有3个种，分别是莽山野柑（Citrus mangshanensis）、沙柑（C. nobilis）、黄柑（C. speciosa），并认为沙柑与王柑、黄岩本地广橘、日本九年母应同属一个种（周开隆和叶荫民，2010）。中外柑橘学术界普遍将沙柑划分柑亚类，并推测沙柑为杂交种（梁国鲁和陈全有，1994）。沙柑的来源不详，目前也未发现野生分布，因此有必要对沙柑进行孢粉学、分子标记及基因组学等的研究，以明确沙柑的起源、演化途径及分类学地位。

花粉是一个极其微小、精致的细胞，它的全部性状包含着丰富的生命信息和科学信息，引起植物学、细胞学、植物分类学、植物系统学、古植物学、植物地理学等多学科关注，给了人们极大的空间去进一步了解和探索，同时孢粉学的知识又成为上述多学科发展理论与应用研究的基础（李天庆等，2011）。植物花粉有其独特的外形、复杂的外壁结构和精细的纹饰，并且在遗传中具有相对较强的保守性和稳定性，这对植物种和品种的鉴定具有重要的意义（王伟铭，2009；武晓晓等，2017）。基于此，本研究利用花粉形態特征对沙柑进行分析，为其遗传演化、分类地位以及亲缘关系的鉴定提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

本研究所用的沙柑和部分试验材料的花粉采自广西特色作物研究院资源圃，其余材料的花粉采自中国农科院柑桔研究所（重庆）、湖南省园艺研究所（长沙），共计22份材料（表1）。

于盛花期选择健壮植株，采集树冠外围中上部含苞待放的花蕾，用消过毒的镊子去掉花瓣和花萼，只留花药，置于烘箱内37 ℃烘24 h以上，将获得的花粉放置于干燥管中低温保存。

1.2 测定项目及测定方法

1.2.1 花粉电镜扫描观察 用牙签挑取少量花粉，均匀的撒在粘有导电胶的样品台上，用离子溅射仪进行真空喷金镀膜，置于FEI Quanta 200场发射环境扫描电镜下进行观察，工作电压为5 kV，选择有代表性的清晰视野进行观察，并拍照保存，800倍观察花粉的整体效果，6 000倍观察花粉的极面和赤道面，24 000倍观察花粉的外壁纹饰特征， 并测量极轴长（P）、赤道轴长（E）、网脊宽度以及网眼直径的大小。

1.2.2 花粉定量特征的测量及统计 每份试验材料随机选取20粒花粉粒进行相关数据的测量和统计，用SPSS软件计算平均值和标准差；选取赤道轴长、极轴长、网眼直径、网脊宽度共4个定量特征，用NTsys-pc软件将数据标准化后进行聚类，聚类单元之间的遗传距离以平均分类距离计算，聚类图选用UPGMA法（陈鹏等，2016）。

2 结果与分析

2.1 花粉的外形大小

沙柑花粉以单粒形式存在，中等大小，花粉粒形状为长球形，极轴长度为（29.98 ± 1.18） μm，赤道轴长度为（22.32 ± 1.03） μm，P/E均值为1.34（表1）。花粉粒具有4条孔沟，极面观为四裂圆形，赤道面观为长圆形（图2）。

2.2 花粉的外壁纹饰

沙柑外壁纹饰为网状纹饰，即由凸起的网脊和网眼组成，网眼和保卫网眼的一半网脊形成一个网胞。经比较观察，沙柑网眼中等大小，形状为圆形或近圆形，网眼直径为（0.89±0.10） μm，网脊平宽光滑且不隆起，宽度为（0.62±0.07） μm。其具体特征见图1至图5。

2.3 聚类结果分析

利用NTsys软件对花粉的表型形状进行了聚类树分析，在遗传距离1.06处，将试验材料分为7个组群（图6）。

第一组包括1，即罗浮金柑，主要特点为花粉粒较小，单独聚为一类；第二组包括2、21，即23号枳和广佛手；第三组为18，即沙田柚，单独为一类；第四组包括3、4，即金刀峡宜昌橙和红河大翼橙，花粉粒特征为网脊较窄；第五组包括7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、19、20、22共13个品种，主要为柑类、橘类和柠檬枸橼类，该类主要特征是花粉粒稍大，网眼直径比网脊宽度要稍大；第六组10，即道县野橘，花粉粒中等大、网眼直径、网脊宽为中等，单独聚为一类；第七组包括5、6，即莽山野柑和姑婆山野生皱皮柑，主要特点为网眼较大，网脊较狭并且突出，两者单独聚为一类。

3 讨论与结论

本研究中，沙柑花粉粒大小、形状及外壁纹饰与扁柑、年橘、广西红皮酸橘相近，推测沙柑与后三者可能存在一定的亲缘关系，特别是沙柑与扁柑可能存在较近的亲缘关系。这与刘通等（2016）利用SSR和SRAP分子标记的结果一致。刘通等（2016）聚类结果显示在遗传距离0.802处沙柑与岑溪酸橘、贺州野橘等聚为一组，表明存在一定的亲缘关系；郭丽英等（2011）对扁柑种质资源亲缘关系进行ISSR分析，认为扁柑在分类地位上属于橘类。本研究中，扁柑先与年橘聚为一组然后与沙柑聚为一组，沙柑又与多个柑橘品种在不同的遗传距离处聚类为组，因此推测沙柑应为杂种起源。这与曾勉（1960）对柑橘分类的结果一致。本研究中，沙柑在遗传距离0.476处与贺州野橘、岑溪酸橘、印度酸橘等聚为一组，与刘通等（2016）的研究结果一致；刘冰浩等（2015）对广西地方柑橘资源ISSR分析分子标记的聚类结果显示，沙柑与南丰蜜橘聚为一组继而又与广西红皮酸橘聚为一组。本研究中，在遗传距离0.442处沙柑与广西红皮酸橘聚为一组，推测沙柑与广西红皮酸橘可能存在一定的亲缘关系。这与刘冰浩等（2015）的研究结果一致。

柑橘花粉形态进化途径通常为较原始的柑橘花粉均为大型、网眼大、网脊比较窄；较进化的柑橘花粉为小型、网眼小、网脊较宽（叶荫民等，1982；刘庚峰等，1992；方从兵，2002；李天庆等，2011）。由花粉形态特征可以推测，沙柑比扁柑、年橘、广西红皮酸橘较原始。但是，沙柑的花粉粒为中等型，网眼直径、网脊宽度在所有试验材料中都处于中等大小，因此推测，沙柑是较莽山野柑（刘庚峰等，1990）、姑婆山野生皱皮柑，姑婆山野生元橘等野生柑橘类型更进化的宽皮柑橘类型。由此推测宽皮柑橘的演化路径为莽山野柑、姑婆山野生皱皮柑→姑婆山野生元橘、贺州野橘、岑溪酸橘、印度酸橘→沙柑、扁柑、年橘→道县野橘→立花橘、沙糖橘，其中道县野橘演化成为一独特的种类。

柑橘大多数种是无融合生殖的，根据花粉对柑橘进行分类具有更重要的意义，花粉大小、网眼大小、网脊状况是区分柑橘分类群的重要特征（周开隆和叶荫民，2010）。花粉不易随外界环境的变化而发生变异，难以被高温高压所破坏，很耐酸碱，同一植物的花粉，不论是现代还是古代的，其形态特征是相同的（韦仲新，2003）。本研究中，花粉外壁纹饰特征受外界条件影响也不大，但花粉的形状和大小受试验条件的影响较大，经醋酸酐分解法处理的花粉较大，极轴较短而赤道轴较长，不经处理的花粉花粉较长，极轴较长而赤道轴较短。因此，花粉形态特征对柑橘的分类以及亲缘关系的鉴定可以提供一定的依据，但需进一步结合解剖学、细胞学、遗传学、生物进化等方面进行更加深入的研究。

本研究通过花粉形态的特征对沙柑进行了分析，结果显示沙柑花粉粒为中等大小，4条孔沟，具有网状纹饰且网眼为圆形或近圆形、网脊平宽光滑且不隆起，与大部分宽皮柑橘的花粉形态特征相似。聚类结果表明沙柑可能与扁柑、年橘、广西红皮酸橘的亲缘关系较近，与贺州野橘、岑溪酸橘、印度酸橘、姑婆山野生元橘等亲缘关系次之，与立花橘、沙糖橘、枸橼、柠檬、橙类有一定的亲缘关系但亲缘关系较远，因此认为沙柑应为杂种起源。本研究结果可以为沙柑的遗传演化、分类地位以及亲缘关系的鉴定提供一定的参考依据。

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