辣椒种子贮藏蛋白质亚基构成及亲缘关系分析

胡志辉， 陈禅友

[江汉大学生命科学学院/湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心，湖北武汉 430056]

辣椒(CapsicumannuumL.)现已成为中国的重要蔬菜和调味品，生产上迫切需要一些优质、抗病、高产的优良品种，加强辣椒种质资源的亲缘关系研究，掌握种质资源的分类地位和亲缘关系是辣椒品种选育上一个新台阶的重要途径[1]。种子贮藏蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，简称SDS-PAGE)成为研究小麦、芸薹属、扁蓿豆、菜豆等植物亲缘关系的有效手段[2-5]，而辣椒种质资源遗传多样性研究报道较少[6-12]。本试验运用SDS-PAGE技术分析辣椒种子贮藏蛋白亚基构成，研究辣椒种质资源的遗传多态性，确定辣椒3个主栽变种12个品种之间的亲缘关系，为辣椒新品种选育工作的开展提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料均为成熟的辣椒种子(表1)，由湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心提供。

表1 供试辣椒品种名称、来源及主要特征特性

1.2 种子贮藏蛋白的提取及电泳

参照胡志辉等的方法[13-14]提取辣椒种子贮藏蛋白并采用SDS-PAGE技术进行电泳。辣椒种子贮藏蛋白提取缓冲液为丙三醇(甘油)5 mL+SDS 1 g+溴酚蓝0.1 g+巯基乙醇2.5 mL，分别用0.2 mL蒸馏水、5%氯化钠溶液、70%乙醇、0.2% NaOH提取上清液，即为水溶蛋白提取液(代号W)、盐溶蛋白提取液(代号S)、醇溶蛋白提取液(代号P)、碱溶蛋白提取液(代号A)。SDS-PAGE分离胶T=12.5%，4 ℃左右条件下15 mA恒流电泳，点样量18 μL，时间约8 h。每个样品重复3次。

1.3 数据处理与统计分析

采用“0，1”系统记录蛋白谱带，构建蛋白谱带数据库。品种间蛋白质图谱相似系数S[15]及品种间遗传距离GD[16]计算公式分别为

S=(品种间共有的条带数)/(2个品种中最多的条带数)；

GD=1-(2nxy)/(nx+ny)。

式中：nxy是2个品种间共有的条带数；nx、ny分别是品种x、y的总条带数。采用系统聚类最短距离法对12个辣椒品种进行聚类分析[17]，绘制聚类图。

2 结果与分析

2.1 蛋白质电泳检测

由图1、表2可知，12个辣椒品种种子贮藏蛋白质经 SDS-PAGE分析未检测到醇溶蛋白，水溶蛋白、盐溶蛋白、碱溶蛋白共检测出25条蛋白质亚基带，有23条多态性带，多态性率为92%，蛋白质亚基分子量分布范围是10 093～96 232 bp，蛋白质亚基出现频率变化幅度为0.08～1.00；点位带编码按分子量顺序排列，碱溶蛋白、盐溶蛋白、水溶蛋白分别检出14、18、19条点位带，其中有9条点位带为3种贮藏蛋白所共有，第1、4、6点位带为碱溶蛋白所特有，第22点位带为盐溶蛋白所特有，第20、21、23点位带为水溶蛋白所特有；蛋白质亚基分子量分别为43 668 bp的第9位点、26 605 bp 的第16位点的点位带在所有品种中都出现，是辣椒品种共同的种子贮藏蛋白质，其他出现频度较高的点位带有簇生椒类品种美国加州干椒王(编号5)缺少的第12点位带、长椒类品种楚风辣椒(编号8)缺少的第10点位带、华椒17号(编号1)缺少的第15点位带、丰力新选8819线椒(编号3)缺少的第24点位带；第2点位带只在丰力新选8819线椒中出现，第5点位带只在紫星2号(编号7)中出现，第21点位带只在红星2号(编号2)中出现；长椒类品种共检测出20条蛋白质亚基带，有17条多态性带，多态性率为85%，都具有第9、12、16点位带，而没有第3、5、14、21、23点位带；灯笼椒类品种共检测出23条蛋白质亚基带，有15条多态性带，多态性率为65%，都具有第9、10、12、15、16、17、24、25点位带，而没有第2、7点位带；簇生椒类品种共检测出15条蛋白质亚基带，没有出现第2、3、5、7、12、18、20、21、22、25点位带。

2.2 品种间的遗传距离及遗传相似系数

由表3可知，利用蛋白位点共计算得到品种间66个相似系数(S)和遗传距离(GD)值，遗传距离变异范围在0.067～0.615之间，平均值为0.278 4；8819线椒(编号4)、丰力新选8819(编号3)的GD值相对最小，为0.067，华椒17(编号1)、红星2号(编号2)的GD值相对最大，为0.615；白星2号(编号11)和红星2号、红妃(编号9)和紫星2号(编号7)、玉妃(编号12)和橙星2号(编号10)的GD值为0.273，处于居中水平，说明品种间有一定的遗传差异。

2.3 聚类分析结果及亲缘关系判断

根据品种间遗传距离的大小，采用系统聚类最短距离法逐级归类可得到聚类图。由图2可知，欧氏距离平方约为5时，可将12个辣椒品种分为2大类，2大类之间的平均遗传距离为0.313 1(平方欧式距离为9.818 7)；第Ⅰ类包括灯笼椒类品种紫星2号(编号7)、美国甜椒(编号6)、红星2号(编号2)、橙星2号(编号10)、白星2号(编号11)和簇生椒类品种美国加州干椒王(编号5)，品种间的平均遗传距离为0.236 7；第Ⅱ类包括长椒类品种8819线椒(编号3)、丰力新选8819(编号4)、楚风辣椒(编号8)、红妃(编号9)、玉妃(编号12)、华椒17(编号1)，品种间的平均遗传距离为0.250 6；最先合并在一起的有美国甜椒和紫星2号(欧氏距离平方为0.058 8)、8819线椒和丰力新选8819(欧氏距离平方为 0.059 9)、红妃和玉妃(欧氏距离平方为0.067 8)，说明这几对品种间具有最近的遗传距离，亲缘关系也较近；簇生椒类变种与灯笼椒类变种在欧氏距离平方为0.115 9时被合并在一起，在欧氏距离平方为9.818 7时又与长椒类变种合并在一起。聚类分析统计结果表明，簇生椒类与灯笼椒类2个变种间具有很近的遗传距离，平均遗传距离为0.223 8，遗传变异程度较小，具有较紧密的亲缘关系；簇生椒类与长椒类2个变种间具有较远的遗传距离，平均遗传距离为0.310 3，遗传变异程度较大，亲缘关系较远；灯笼椒类与长椒类2个变种间的遗传距离相对最远，平均遗传距离为0.313 1，遗传变异程度相对最大，亲缘关系最远。

3 结论

采用SDS-PAGE分析辣椒3个主栽变种12个品种的种子贮藏蛋白质亚基组成，未检测到醇溶蛋白，水溶蛋白、盐溶蛋白、碱溶蛋白共检测出25条蛋白质亚基带，多态性率为92%，亚基分布范围是10 093～96 232 bp，蛋白质亚基出现频率变化幅度为0.08～1.00。长椒类品种共检测出20条蛋白质亚基带，多态性率为85%；灯笼椒类品种共检测出23条蛋白质亚基带，多态性率为65%；簇生椒类品种共检测出15条蛋白质亚基带。采用系统聚类最短距离法对12个辣椒品种进行聚类分析，12个品种被分为2大类，类内的平均遗传距离分别为0.236 7、0.250 6，类间的平均遗传距离为0.313 1。簇生椒类与灯笼椒类2个变种间具有很近的遗传距离，平均遗传距离为0.223 8，变种间的遗传变异程度相对较小，具有较紧密的亲缘关系；簇生椒类与长椒类2个变种间具有较远的遗传距离，平均遗传距离为0.310 3，变种间的遗传变异程度较大，亲缘关系较远；灯笼椒类与长椒类2个变种间的遗传距离相对最远，平均遗传距离为0.313 1，变种间的遗传变异程度相对最大，亲缘关系也最远。

表2 12个辣椒品种种子贮藏蛋白电泳出现点位带数和出现频度

表3 12个辣椒品种间的遗传距离及遗传相似系数

注：对角线右上方的数字为遗传距离，对角线左下方的数字为相似系数。