用Chelex-100法大规模快速提取牦牛肌肉中基因组DNA

周凡莉，黄 林，金素钰，郑玉才

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

动物基因组DNA提取方法包括十二烷基磺酸钠(SDS)法、酚-氯仿抽提法、碱裂解法、试剂盒提取法等[1].其中酚-氯仿抽提取法实验过程复杂、耗时，容易产生交叉污染，使用有害试剂；而试剂盒法操作过程较多，大规模使用成本较高；Chelex-100法近年来被广泛使用，适应于微量样品提取DNA[2-3].Chelex-100树脂可去除样品和缓冲液中的金属离子，防止DNA降解，操作简便，已用于血液、乳、蚊虫附肢、眼角膜、肝脏和肌肉、口腔黏膜细胞等生物材料提取基因组DNA[4-9].

用Chelex-100法提取DNA的全部过程在同一个EP管中进行，污染机会少，检材损失小，适用于微量生物样品的DNA提取，虽然提取的DNA纯度不高，但作为PCR反应模板制备方法具有很大的优势[10].肌肉组织是常见的实验材料.本研究尝试建立用Chelex-100法快速提取牦牛肌肉中基因组DNA，以便为开展大规模的分子遗传学研究提供材料.

1 材料与方法

1.1 样品的采集与处理

九龙牦牛背最长肌采自四川省甘孜州的九龙县.在冬季牦牛屠宰时，采集背最长肌，迅速冰冻后用冰瓶带回实验室，-80℃保存至分析.样品分析时已经在该条件下保存长达9年.本研究取10个背最长肌样品进行试验.

1.2 肉中基因组DNA的提取

参考Amills等提取乳样DNA的方法[11]提取肌肉中基因组DNA.主要步骤如下：1.5 mL的EP管中加入100 μL 的 5%Chelex-100和2 μL 的 20 mg/mL 新鲜蛋白酶K，加入肌肉组织，涡旋10 s；56℃金属浴孵育30 min；保温结束后于100℃沸水浴变性8 min，迅速置于冰上冷却3 min；涡旋10 s，8000 g离心1 min，上清液分装备用，-20℃保存.

本研究中试验的肌肉保持冰冻状态，采取两种方法取样.方法一(镊子取样)：用干净的镊子，迅速取小米粒大小的肌肉；方法二(枪头取样)：采用倾斜修剪的200 μL枪头，迅速插取肌肉，该方法在枪头上并未见明显的肌肉组织.

1.3 PCR引物的设计

用PCR扩增核基因和线粒体基因.根据GenBank数据库中普通牛的Prdm 9(登录号：KJ020105)，利用Primer Premier 5.0软件设计Prdm 9基因的PCR引物.扩增牦牛Cytb和CSN2基因分别参考胡强等[12]和McLachlan[13]研究中的引物.3个基因的引物序列和预期扩增长度等信息见表1.引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成.

表1 PCR引物信息Table 1 The information of PCR primers

1.4 PCR扩增与检测

Prdm9、Cytb和CSN2基因的PCR扩增反应体系(25.5 μL)：金牌Mix(Green)22 μL，DNA 模板1.5 μL，上、下游引物各1 μL.PCR扩增条件：98℃预变性3 min；98 ℃变性30 s；退火(温度见表1)30 s；72 ℃延伸(3个基因依次为40 s、15 s、10 s)，共计35个循环；72℃延伸5 min.PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测.

1.5 PCR产物的测序与分析

为验证PCR产物可用于后续研究，将Cytb基因的PCR产物送上海生工生物公司进行正向测序，利用DNAman软件与普通牛(登录号：AY885283)和普通牦牛(登录号：KM280686)序列进行比对.

2 结果

2.1 镊子取样提取肉中基因组DNA的PCR扩增

牦牛肌肉样品用镊子取样后提取基因组DNA，PCR扩增CSN2、Cytb和Prdm9基因，发现3个基因的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上均显示出单一的清晰条带，分子量大小与预期片段大小吻合(图1).3个基因的扩增效果均存在样品个体差异，如牦牛Cytb基因扩增产物的电泳条带的亮度存在较明显的个体差异(图2).

2.2 枪头取样提取肉中基因组DNA的PCR扩增

牦牛肌肉样品用枪头取样后提取基因组DNA，PCR扩增Cytb基因，PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上均显示出单一的清晰条带，分子量大小与预期片段大小吻合.PCR循环数与扩增效果有关，大部分样品PCR扩增35个循环的产物可用于直接测序(图3).

图1 九龙牦牛CSN2、Cytb和Prdm9基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1-3：CSN2、Cytb和 Prdm9 基因；M：DNA Marker 2000.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of CSN2，Cytb and Prdm9 genes of Jiulong yak

图2 九龙牦牛Cytb基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1-7：Cytb基因；M：DNA Marker2000.Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of Cytb gene of Jiulong yak

图3 九龙牦牛Cytb基因不同循环数的PCR产物琼脂糖凝胶电泳1-3：45 个循环；4-6：35 个循环；M：DNA Marker 2000.Fig.3 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of Cytb gene in Jiulong yak with different cycles

2.3 PCR扩增产物的直接测序

对九龙牦牛Cytb基因的PCR产物进行正向测序，结果与数据库中的普通牦牛(登录号：KM280686)、普通牛(登录号：AY885283)序列进行比对，发现九龙牦牛与普通牛的序列存在差异，但与普通牦牛的序列高度一致(图4).说明用Chelex-100法提取的牦牛肌肉中基因组DNA，PCR扩增的产物可直接测序，并获得正确的序列.

图4 九龙牦牛、普通牦牛和普通牛的Cytb基因序列信息比对Fig.4 Sequence alignments of Cytb gene of Jiulong yak，yak and cattle

3 讨论

近年来Chelex树脂越来越多地应用于提取动物基因组DNA，国内外均有不少报道[3，14].Algriw等研究表明，Chelex-100和试剂盒均适用于提取肝脏和肌肉基因组DNA，且Chelex-100方法提取的产量更高.Chelex-100法是一种廉价、快速、有效的提取DNA的技术[11]，本试验用该方法提取肌肉中的基因组DNA，整个过程只需要约30 min，而Cytb基因的PCR产物序列与普通牦牛、普通牛序列信息比对(图4)，证明了Chelex-100法提取的基因组DNA的完整性，说明该方法适用于快速提取肌肉组织的DNA，并且对后续实验无影响.

提取肌肉等组织DNA时，一般先定量取样并匀浆，再进行后续提取实验[15].这种方式用于大规模提取DNA时，工作量大且费时长.大规模提取肌肉组织DNA时，用镊子取样工作量大，增加交叉污染的可能.本研究采用的枪头取样简单易行，无交叉污染，适用于大规模取样，并且是在样品冰冻条件下进行.本研究比较了冰冻肌肉样品的两种取样方法，扩增2个核基因和1个线粒体基因，产物长度约300 bp～900 bp，均获得了正确的结果.不足之处在于两种取样方法均无法准确定量，尤其是枪头取样更难以控制取样量，这导致PCR产物的电泳条带亮度有个体差异.

对于没有准确称量的组织样品，Chelex-100法提取微量的DNA作为模板进行PCR扩增，需要适当调整循环数.本试验中枪头取样提取的DNA作为模板进行PCR扩增时，35个循环后一些样品扩增产物浓度不是特别高，可能不能用于直接测序，需要适当增加循环数，这与Amills等从乳中提取DNA进行PCR的研究结果一致[11].

本研究表明，可用修剪后的一次性枪头对冰冻肌肉进行取样，采用Chelex-100法快速、大规模提取牦牛肌肉中的基因组DNA，用于PCR扩增和后续的研究.