牛源MRSA新疆流行株毒力基因检测及Agr分子分型研究

孟 丹， 孟庆玲， 乔 军， 蔡扩军， 于伟伟， 伍晔晖， 才学鹏， 陈创夫

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003)

金黄色葡萄球菌是一种感染人畜最为常见的病原菌[1]。目前，人类医源感染的病原菌多为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methcillin resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，会引起深部感染以及皮肤感染，具有较高的发病率和病死率[2]。动物源特别是牛源MRSA感染易引起奶牛严重的乳房炎和子宫内膜炎，给奶牛养殖业带来严重的经济损失。美国疾病预防控制中心报告，在细菌感染引起的疾病中，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第2位，仅次于大肠杆菌[3]。此外，一些致病性金黄色葡萄球菌能够产生多种致病因子，如lukF、lukS、hla、hlb等，这些致病因子可诱发炎症，并引起组织损伤，加剧了临床治疗难度[4]。

金黄色葡萄球菌能够分泌多种毒素和酶，这些毒力蛋白的表达由RNA Ⅲ调控，它是Agr(accessory gene regulator)位点转录的一个中心多向调节因子。目前，认为RNAⅢ至少是由2个双组分系统激活，这2个双组分系统一个是由agr位点编码的AgrC与AgrA，在金黄色葡萄球菌中，研究最清楚的双组分调节系统是AgrCA[5]。金黄色葡萄球菌的大多数毒力因子是由Agr位点调控，基于Agr编码的自动诱导肽和相关受体的氨基酸序列多态性，学者们把金黄色葡萄球菌Agr分成4个主要基因型(Ⅰ～Ⅳ)[6]。为此，本研究利用多重PCR技术，分析了新疆地区MRSA不同流行株的Agr基因型的流行状况，并检测了MRSA流行株的部分毒力基因携带状况，以期了解MRSA新疆流行株的分子特征，为进一步研究毒力基因与Agr不同基因型之间的内在联系，以提供流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

甘露醇高盐琼脂培养基、BHI液体培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司；大肠杆菌(E.coli)DH5α菌种，由笔者所在实验室保存；细菌基因组DNA提取试剂盒、pMD19-T载体，DNA Marker，均购自TaKaRa公司；生化鉴定管，购自杭州滨和微生物试剂有限公司；抗菌药物纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；质粒小量提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒，购自诺维森(北京)生物科技有限公司。

1.2 样品的采集

分别从新疆五家渠、石河子、沙湾、乌鲁木齐4个地区的规模化奶牛场，采集临床型乳房炎和子宫内膜炎样品221份，乳样采集通过温水清洗乳房并使用75%乙醇棉球对乳头进行消毒处理，收集第3把奶后的奶样。子宫内膜炎样品通过直肠把握子宫直接采样法收集，放于灭菌的试剂管中，置于冰盒中，运送实验室进行分离培养。

1.3 引物

根据GenBank中已公布的金黄色葡萄球菌的耐药基因mecA序列和部分毒力基因序列，应用primer 5软件设计引物，再送至北京华大生物科技有限公司合成备用。本研究中所用的主要耐药基因和部分毒力基因的引物设计见表1。

表1 耐药基因和部分毒力基因的引物

1.4 分离鉴定

将采集的样品接种于甘露醇高盐琼脂培养基，放置于 37 ℃ 恒温箱培养12～48 h。挑取具有典型特征的单菌落，在营养琼脂培养基上进行纯化培养，对纯化菌进行涂片、革兰氏染色、镜检。随机选取分离株用SA生化鉴定管测定其生化反应特性，根据GenBank中已公布的金黄色葡萄球菌16S rRNA的序列设计通用引物，对SA分离株进行16S rRNA序列比对分析，鉴定分离株为金黄色葡萄球菌。将分离的金黄色葡萄球菌在BHI肉汤中37 ℃培养24 h，再将500 μL所得新鲜菌液加入到500 μL 40%甘油中振荡混合均匀制成20%甘油菌，-20 ℃保存备用。

1.5 药敏试验及MRSA确证方法

用无菌接种环挑取单个菌落，接种于BHI培养液于 37 ℃ 培养20～24 h，再用灭菌生理盐水将细菌浓度调至0.5麦氏浊度，取200 μL均匀涂布于MHA培养基，涂布均匀后贴上苯唑西林药敏纸片，用镊子轻压纸片使其与培养基表面紧密接触。放置37 ℃恒温培养箱中培养48 h后测量抑菌圈直径。进一步通过PCR方法扩增mecA来确定MRSA阳性菌。判断30 μg苯唑西林抑菌环直径≤1 cm的菌株，即为MRSA。

1.6 毒力基因的检测

采用多重PCR的方法[7]对毒力基因白细胞毒素基因(PVL、lukED、lukM)、溶血素基因(hla、hlb、hld)、表皮剥脱素基因(eta、etb)、中毒休克综合征毒素基因tst和黏附素基因edin进行检测。

1.7 菌株基因组DNA提取

用无菌接种环挑取单个菌落接种至无菌BHI培养液于37 ℃振荡过夜，取1.5 mL细菌培养液于无菌EP管内在 12 000 r/min 下高速离心，弃去上清后，按细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明进行后续试验。DNA提取结束后，采用4 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后在凝胶成像系统上照相。DNA模板于-20 ℃保存，用于Agr分型研究。

1.8 Agr基因分型

根据Agr等位基因(Ⅰ～Ⅳ)4种类型，引物合成参照文献[8]进行。采用多重PCR扩增4种类型的基因，PCR扩增条件如下：95 ℃，5 min；95 ℃，40 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。扩增后，取其产物10 μL进行琼脂糖凝胶电脉(1.5%)，80 V40 min，凝胶成像系统照相，观察扩增条带，比较电泳图像。

2 结果与分析

2.1 MRSA的分离与鉴定

从新疆4个不同的牛场采集了221份样，共分离到71株金黄色葡萄球菌，在甘露醇高盐培养基中长出黄色或乳白色菌落(图1)。其中MRSA有13株，4株来自沙湾，4株来自乌鲁木齐，2株来自石河子，3株来自五家渠(表2)。并且13株菌的mecA基因检测均为阳性。MRSA流行株占5.9%(13/221)。

表2 13株MRSA毒力基因的检测结果

2.2 MRSA毒力基因的检测

13株MRSA经PCR扩增10对毒力基因，出现3种毒力基因特征性条带(图2)。其中，2株同时检出毒力基因hld、lukED、tst，1株同时检出毒力基因hld、tst，2株仅检出毒力基因TST，其他菌株均检出毒力基因lukED、TST，可见除3株菌检出溶血素毒力基因hld外，白细胞毒素基因lukED和中毒休克综合征毒素基因tst为主要检测出的毒力基因(表2)。

2.3 Agr基因分型结果

由图3、表3、图4可知，13株MRSA流行株Agr分型出现2种特征性条带，均为AgrⅠ型和AgrⅣ型，且每株菌同时具有2种分型，其中AgrⅡ型和AgrⅢ型均未检出，Agr分型与毒力基因的分布存在一定的差异。

3 讨论

目前，MRSA仍然是全世界感染的最严重的病原菌之一，并且呈不断增加的趋势[9]。与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌相比， MRSA具有更强的引发患畜感染及发生菌血症的能力[10]，而这与MRSA携带的独特的毒力因子密切相关。一般来说，MRSA的主要毒力因子有肠毒素、杀白细胞毒素、溶血素、毒性休克综合征毒素等，这些毒力因子因具有不同的生物学特性而呈现出不同的致病特征[11]。在本研究中，从13株MRSA中共检出hld、ukED、tst这3种毒力基因，其中lukED和tst检出率相对较高， 且出现同一株菌携带3种或2种毒力基因的情况，表明MRSA的毒力差异不仅体现在菌株之间，还与细菌本身的进化以及宿主因素的影响关系密切。而对于检出的hld是1种溶血素，可在宿主细胞膜上形成小孔，造成细胞内液外流而导致细胞破坏[12]。lukED属于一种白细胞毒素，是MRSA的重要毒力基因，可以对抗宿主的免疫系统[13]。tst主要与编码基因的一些特定可移动序列有关，可表达tst-1，是一种超抗原，能够直接活化T淋巴细胞，使其在感染患者体内释放出炎症介质而导致机体发病[14]。MRSA及其携带的hld、lukED、tst毒力基因的流行，使其成为牲畜感染的主要致病菌，给患畜的抗感染临床治疗带来了严峻挑战。因此，检测MRSA的毒力基因可为临床治疗及感染控制提供依据。

表3 13株MRSA流行株Agr分型

金黄色葡萄球菌附属基因调节系统Agr是最早发现的金黄色葡萄球菌调控位点[15]。同时，也被认为是金黄色葡萄球菌最重要的群集感应系统，它影响着许多外毒素和胞外蛋白的分泌表达[16]。金黄色葡萄球菌附属基因调节子(Agr)位点是一个全面的群集感应系统并且控制着毒力因子的产生。尽管Agr基因在细菌的毒力调节上具有重要的影响，研究表明大量的抗生素使用会造成金黄色葡萄球菌出现Agr阴性，抗生素产生的耐药也会使毒力出现一定程度的下降[17-18]。可见Agr基因与抗生素、毒力因子之间可能存在一定的联系。王琼等针对人源、牦牛源、食品源、鸡源和羊源金黄色葡萄球菌分离菌株进行Agr基因分型检测出AgrⅡ、AgrⅢ、AgrⅣ 3种型[19]。Xie等的研究表明，108株医院源菌株分离菌株中，AgrⅠ型占据最流行地位[20]。在本研究中，从新疆牛源MRSA菌株中检出Agr Ⅰ和Agr Ⅳ型，Agr Ⅳ与王琼等从不同来源的样品中检出的Agr型相同，Agr Ⅰ与Xie等从医院源菌株检出的Agr型[20]相同，可见MRSA有可能在Agr基因水平上有人畜间传播的可能。本研究为MRSA分离株的分子分型奠定一定基础，同时也为进一步探讨MRSA毒力因子与Agr之间的相关性奠定基础。

近年来，随着新疆地区奶牛饲养方式的改变，奶牛规模化养殖迅速发展，乳房炎和子宫内膜炎已经成为奶牛的高发病和常发病，成为制约新疆奶牛业发展的瓶颈。为了防治奶牛乳房炎和子宫内膜炎，在兽医临床上大量使用抗菌药物，导致MRSA菌株不断出现，给该病的防控和人们健康带来了严重的威胁。国内外学者在奶牛上检出MRSA菌株日益增多，而且随着MRSA菌株的不断遗传进化，耐药表型、传播规律和致病机理越来越复杂，提示牛源的MRSA与人源MRSA之间的关系越来越密切，MRSA在人畜之间，甚至不分国界的传播与扩散也越来越严重。因此，开展牛源MRSA分子流行病学和毒力基因检测研究，对于防控型人-畜之间MRSA的相互传播至关重要。