果香型米醋的研制及风味分析

吴光忠，何炯灵，黄炳文，蒋予箭*

(1.绍兴至味食品有限公司，浙江 绍兴 312050；2.浙江工商大学 食品与生物工程学院，杭州 310012)

果醋是以水果为主要原料，经酒精发酵和醋酸发酵酿制而成的一种营养丰富、风味优良的饮品，粮醋是以大米等粮食为主要原料经酒精发酵和醋酸发酵酿制而成的一种酸性调味品[1]。近几年来，在果醋的风味组成、醋酸发酵过程控制、固定化发酵方式及耐高酸度醋酸菌选育等方面有较多研究，相比之下，对果醋、米醋发酵产品的市场开发的研究就显欠缺[2-4]。把粮醋的发酵与果醋的发酵相结合，一方面降低了果醋的生产成本，另一方面拓宽了粮醋的应用市场。本实验以猕猴桃果汁和糯米为原料分别生产果酒、米酒，按一定比例将米酒、果酒混合，接种醋酸菌发酵，制得果香型米醋[5]。用气质联用色谱和高效液相色谱对不同比例果酒、米酒混合发酵的果醋样品进行香气成分和有机酸含量的检测，考察不同果酒、米酒配比下发酵制得的果香型米醋的风味特征，为开发此类新产品积累科学数据[6-11]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米、猕猴桃：购于超市；安琪果酒活性干酵母：湖北安琪酵母有限公司；果胶酶：江苏锐阳生物科技有限公司；沪酿1.01醋酸菌：上海迪发生物有限公司。

甲醇为色谱级，磷酸二氢铵为分析纯，草酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、醋酸、柠檬酸、琥珀酸标准品的纯度均大于99%。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；LC-2010A HT高效液相色谱仪 日本岛津有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；ATC手持式糖度仪 南京科航实验仪器有限公司；SPX-250B-Z恒温培养箱 上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

工艺流程图见图1。

图1 工艺流程图Fig.1 Process flow diagram

1.3.2 果醋发酵工艺

1.3.2.1 猕猴桃汁酶解

成熟猕猴桃经过剥皮、破碎、打浆之后，加入0.08%的果胶酶[12]，在50 ℃水浴中酶解2 h，然后再将水浴温度调至80 ℃，保持15 min，解除果胶酶的活性。冷却至室温后，用蔗糖或者白砂糖调糖酸比至手持式糖度仪测定读数为20 °Bx。

1.3.2.2 酵母菌活化

用天平称取7 g活性干酵母加入到100 mL、2%已灭过菌的葡萄糖溶液中，用38 ℃水浴锅活化45 min，得到活化好的酵母菌。

1.3.2.3 猕猴桃汁酒精发酵

用血球计数法计算酵母菌液中的酵母数[13]，按1×107个/mL接种量计算所需酵母原液量加入到果汁中，搅匀后置于锥形瓶中并用牛皮纸封口，置于28 ℃培养箱中培养约5天，当酒精度不再上升时酒精发酵结束。

1.3.2.4 醋酸发酵

大量文献表明醋酸发酵的最佳酒精度为6%(V/V)[14,15]，故将猕猴桃酒和米酒的酒精度均调至6%后按照不同比例混合，接种10%的醋酸菌，置于30 ℃发酵至酸度不再上升。

1.3.3 香气成分的测定方法

取样品5 mL置于20 mL顶空瓶中，然后用带有硅橡胶隔垫的瓶盖密封。将顶空瓶放入50 ℃水浴锅平衡30 min，然后将萃取头插入顶空瓶中距离液面2 cm处，50 ℃下吸附30 min，取出后插入GC进样口，240 ℃下解吸2 min，进行GC-MS分析。

色谱柱：DB-WAX，60 m×0.25 mm×0.5 μm(柱长×内径×膜厚)；进样口温度：240 ℃，不分流进样，载气为氦气，恒流模式，柱流速：1 mL/min；柱温：30 ℃，保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

离子源：EI；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；质量数扫描范围：33～500 amu。

1.3.4 有机酸的测定方法

用电子天平准确称取草酸40 mg，苹果酸及酒石酸各200 mg，抗坏血酸30 mg，乳酸500 mg，醋酸6000 mg，柠檬酸700 mg以及琥珀酸180 mg，用超纯水定容至100 mL，混合均匀后从中吸取1,3,5,7,9 mL，分别用超纯水定容到10 mL,配成不同浓度的混合标样，用0.45 μm有机系微孔滤膜过滤后,绘制各有机酸的标准曲线。

通过前期的实验得到的液相色谱条件为：色谱柱：Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速： 0.5 mL/min；柱温：25 ℃； 检测波长：210 nm； 进样体积：5 μL；流动相：5 g/L磷酸二氢铵(磷酸调pH至2.5)。

将发酵好的米醋、猕猴桃醋以及用米酒、猕猴桃酒不同比例混合发酵的混合果醋在15000 r/min的条件下离心20 min后过0.45 μm微孔滤膜，进行HPLC定量分析，每个样品进样3次，取平均值。

1.3.5 感官评价方法

根据果醋感官评定规则，对纯猕猴桃醋、米醋以及用不同比例混合的猕猴桃酒和米酒发酵而成的果醋进行感官评定，感官评价员为10人(3人来自果醋酿造企业，7人来自实验室，都经过相关的感官鉴定培训)，总分为100分，每次将10名评价员的结果进行平均，可在备注栏里写上对该样品的评价。由于原醋酸度较大，故在进行滋味品尝时先稀释一定的、相同的倍数。自制果醋的感官评价标准见表1。

表1 自制果醋的感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards of self-made fruit vinegar

1.3.6 理化指标测定

酒精度测定：蒸馏法；

总酸含量测定：酸碱中和滴定法；

还原糖测定：斐林试剂法。

2 结果与分析

2.1 香气物质检测结果

用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用法分析比较了稀释到6%的猕猴桃酒、米酒混合果酒，两者单独发酵而成的果醋以及混合发酵产生的果醋的香气成分[16]。共分离鉴定了52种香气成分(见表2)，主要包括酸类、醇类、酯类、醛类、酮类以及酚类这6种化合物，其相对含量比较见表3。

表2 4种样品香气成分GC-MS分析结果Table 2 GC-MS results of aroma components of four samples

续 表

表3 各样品香气物质种类及其含量比较Table 3 Comparison of aroma components and their content in various samples

由表2和表3可知，采用GC-MS在4种样品中共鉴定出52种香气成分，这些成分包括酸类11种、醇类12种、酯类20种、醛类3种、酮类3种、酚类3种。对于果醋来说，含量最多的为酸类香气物质(主要为醋酸)，相对含量依次为：纯猕猴桃酒发酵醋(77.93%)>果酒米酒混合发酵果醋(58.31%)>米醋(44.85%)，其酸的种类也有所差异，依次为：混合果醋(11种)>米醋(9种)>猕猴桃醋(8种)，由此可看出混合发酵果醋的酸类香气物质相对含量介于猕猴桃醋和米醋之间，但酸的种类比两者都要高，这有利于增加果醋的风味和嗅觉感受。在醇类含量方面，相对含量和种类均为混合发酵的果醋最佳。酯类化合物主要是在发酵过程中由有机酸与醇发生酯化反应以及微生物代谢形成的，能产生果香味和花香味，米醋中酯类所占比例较高，达37.6%，其中以乙酸异戊酯、琥珀酸二乙酯、乙酸苯乙酯含量较多，但种类是混合发酵果醋最高，有15种之多。此外，香气成分中的醛类、酮类和酚类种类均为混合果醋>米醋>猕猴桃醋。总的来看，3种果醋的香气成分种类数量依次为：混合果醋(43种)>米醋(33种)>猕猴桃醋(32种)。故将猕猴桃酒和米酒混合后发酵可以集合两者的风味，使得果醋中的香气成分大大增加，酸味更醇厚，醇、酯类香气物质增加，香气更加协调和多样，提高果醋的品质。

2.2 有机酸检测结果

将发酵好的米醋、猕猴桃醋以及用米酒、猕猴桃酒按不同比例混合发酵的混合果醋分别进样检测各特征性有机酸，其HPLC分析图谱见图2，测定的有机酸含量见表4。

图2 等比例混合发酵果醋中有机酸HPLC分析色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of fruit vinegar fermented by equal amount of kiwi wine and rice wine

有机酸种类有机酸含量(g/dL)果酒米醋猕猴桃醋猕∶米为3∶1猕∶米为2∶1猕∶米为1∶1猕∶米为1∶2猕∶米为1∶3草酸0.01220.01130.02350.02890.02880.01970.01750.0157酒石酸0.09740.06810.16350.18340.17690.14580.14110.0913苹果酸0.04440.0390.03870.04650.04370.03970.03720.0303抗坏血酸0.05190.00790.0310.04440.04730.03520.03120.0159乳酸0.29840.27420.05330.10190.12460.15040.16770.1991醋酸0.19094.32185.82585.43094.89445.36165.0444.6365柠檬酸0.24130.10160.48820.73860.52860.48180.36980.213琥珀酸0.0310.03810.11790.01370.09930.08250.06610.0947特征性总酸0.96754.8626.74196.58835.94366.31675.87465.2965

由图2和表4可知，各样品特征性总酸含量为：纯猕猴桃醋>猕猴桃酒米酒(3∶1>1∶1>2∶1>1∶2>1∶3)发酵果醋>纯米酒醋，说明不同比例米酒和猕猴桃酒混合后发酵生产的果醋中的特征性有机酸含量差异较大。其中草酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、柠檬酸都随着混合果酒中的猕猴桃汁含量减少而减少，且在米酒的添加量少于猕猴桃酒时这几种酸的含量均大于纯猕猴桃汁发酵，由此可看出混合果醋中这几种特征性有机酸主要是由猕猴桃汁发酵产生的，而少量添加米酒(米酒所占比例少于果酒)时又可以促进这几种有机酸的产生。乳酸随着米酒含量的增加而有所上升，说明这种有机酸大部分来源于米酒发酵。发酵产生的醋酸含量为：纯猕猴桃醋>猕∶米(3∶1>1∶1>1∶2>1∶3>2∶1)>纯米醋，说明配比不同产生的醋酸含量有所不同，可能原因是不同配比产生的不同生长环境对于醋酸菌的生长和产酸能力产生了较大的影响。由此可以得出，在猕猴桃酒发酵时混入适量米酒可以增加非挥发性有机酸的含量，从而增加果醋的风味。

2.3 不同比例混合发酵果醋感官评价结果

将猕猴桃酒和米酒以不同比例混合进行发酵产生的果醋从色泽、香气、滋味和形态这4个方面进行感官评价，由10名评价员进行打分，总分以各项平均分计，结果见表5。

表5 不同比例混合发酵的果醋感官评价结果Table 5 Results of sensory evaluation of fruit vinegar mixed with different proportions

由表5可知，当猕猴桃酒和米酒的混合比例不同时，其发酵产生的果醋的风味也有所不同。从色泽和形态方面来看，纯猕猴桃汁发酵的果醋色泽亮度较好，澄清度高，而当米酒的加入量过多时，会使得果醋的色泽变得较为暗淡，但适量地加入米酒可以使果醋的色泽呈现较好看的琥珀色。从香气方面来看，纯猕猴桃酒发酵而成的果醋虽果香味较好，但醋酸味较刺鼻，且酯香等其他香气成分不明显，米酒的加入可以增加果醋的酯香等香气成分，调和酸味，使得香气成分更加协调，但当米酒的加入量超过猕猴桃酒时又会使果香味显得不足。从滋味方面来看，当米酒的混合量不超过猕猴桃酒时，会使得发酵果醋酸味柔和，略带甘甜，滋味较佳。从综合评分可以看出，当猕猴桃酒和米酒以1∶1或者2∶1混合发酵时产生的果醋风味最佳。

3 结论

用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用法(HS-SPME-GC-MS)分析比较了纯猕猴桃、纯米酒以及两者混合发酵的果醋的香气成分，共分离鉴定了52种香气成分，主要是酸类、醇类、酯类、醛类、酮类以及酚类这6种化合物，发现混合发酵果醋的总的香气成分最多，共有43种，且每种香气成分种类均大于或等于猕猴桃和米酒单独发酵产生的醋，由此可说明在猕猴桃酒发酵过程中添加米酒可以增加果醋的各方面香气成分，使香气更加协调多样。

加入适量米酒可以增加除醋酸外的特征性有机酸的含量，使酸味柔和、醇厚。从感官评价分析可看出，当猕猴桃汁和米酒的混合比例为1∶1或者2∶1时，其口感较佳，评分较高。再结合成本考虑，米酒的价格远低于猕猴桃汁，故本实验将最后的配比定为6%猕猴桃酒∶6%(V/V)米酒为1∶1。

综上，将米酒作为原料加入到果醋的发酵中，可以在降低果醋生产成本的同时为米酒的开发利用提供新的途径，此外，米酒的适量加入还可以增加果醋的香气物质种类和特征性有机酸含量，有利于改善果醋风味，提高果醋的品质，可以为今后果醋行业的发展提供一种新的思路和研究方向。