苏格木勒-4抗失眠药效学研究

果佳霖 孙利东 孟根花 白东浩 那木希来 查干夫 马丽杰 靳尚武

通讯作者：马丽杰 靳尚武

苏格木勒-3味汤是蒙医传统药方, 出自蒙医经典著作《四部医典》,《 蒙医百科全书》、《蒙药方剂学》(统编教材)均有记载［1］。本研究使用的苏格木勒-4是根据蒙医查干夫教授改良传统配方后的配方, 即在原方白豆蔻15 g、白苣胜10 g、荜菝5 g的基础上, 添加炒酸枣仁15 g。方中酸枣仁味甘,性平；白豆蔻味苦、辛, 性温, 为镇赫依主药；白苣胜味甘,性平, 为镇赫依辅助药；加配调理体素药荜菝, 四药合用,相互协调, 主治失眠, 为安神的良药［2,3］。苏格木勒-4虽然在临床实践中取得了显著的抗失眠药效, 但其作用机制还需进一步研究予以阐明。本文通过苏格木勒-4味汤对小鼠镇静催眠作用影响的实验研究, 为苏格木勒-4味汤的进一步探索提供参考依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 ICR小鼠120只, 雄性, 体质量18～22 g, 由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供, 动物合格证号:SCXK(京 )2016-0002。

1.2 仪器 小动物活动记录仪, 型号：YLS-1C, 济南益延科技发展有限公司；电子天平, 型号：AL204-IC, 梅特勒-托利多；真空干燥箱, 型号：DZF-2B, 北京市永光明医疗仪器有限公司；旋转蒸发仪, 型号：R-215, Buchi；台式高速冷冻离心机, 型号TGL-20M；小动物体重秤。

1.3 药材 白豆蔻为姜科植物白豆蔻Amomum kravanh Pierre ex Gagnep和爪哇白豆蔻Amomum compactum Soland.ex Maton的果实, 批号：20160801；白苣胜为菊科植物莴苣Lactuca sativa L.的种子, 批号：20160401；荜茇为胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper) 植物荜茇(Piper longum L.)的干燥近成熟或成熟的果穗, 批号：20170101；酸枣仁是鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa (Bunge) Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子, 批号：20161201。药材均购自安徽和济堂中药饮片有限公司。

1.4 药物制备 由白豆蔻15 g、白苣胜10 g、荜菝5 g、炒酸枣仁15 g组成, 称取以上4味药材共10付, 共计450 g, 加10倍水, 浸泡1 h后煎煮, 煮沸后30 min滤过, 药渣加5倍量水煎煮, 煮沸后20 min滤过, 合并滤液, 采用旋转蒸发仪、减压干燥器浓缩至浸膏状, 得浸膏58 g。使用时用蒸馏水稀释成相应生药浓度。

1.5 小鼠自主活动测定 ICR雄性小鼠120只, 适应性喂养7 d后, 实验前, 筛选合格小鼠。筛选方法：将120只小鼠分别置于小鼠自发活动仪中, 8只/次, 使之适应环境5 min后,记录5 min内的活动次数, 选取活动数相当的小鼠100只用于实验。实验在光照节律12L∶12D(9:00～21:00), 安静、通风、室温22℃左右的屏障环境下进行。将筛选后的100只小鼠按体重分为正常对照组、安神补脑液对照组及苏格木勒-4高剂量组、苏格木勒-4中剂量组、苏格木勒-4低剂量组, 各20只。将小鼠依次放入小鼠自发活动仪中, 使其适应环境5 min后, 记录5 min的自主活动数。之后, 各组小鼠以0.2 ml/10 g体积灌胃给药。安神补脑液对照组按照0.13 ml/10 g浓度灌胃给药, 苏格木勒-4高剂量组、苏格木勒-4中剂量组、苏格木勒-4低剂量组分别以52 mg/10 g、26 mg/10 g、13 mg/10 g(以生药含量算)浓度灌胃给药。灌胃前禁食不禁水12 h, 灌胃1 次/d, 连续灌胃7 d, 末次灌胃给药60 min后, 以同样方法记录小鼠的自主活动次数。

1.6 戊巴比妥钠催眠作用

1.6.1 实验方法 各组小鼠灌胃给药1 次/d, 连续7 d, 并于末次给药后1 h, 腹腔注射阈剂量戊巴比妥钠溶液(预实验确定为39 mg/kg) 。

1.6.2 判断指标 ①翻正反射消失：小鼠仰卧1 min内未翻转, 说明已进入翻正反射消失阶段；②翻正反射恢复：小鼠能够由仰卧位自动翻转过来并且在1 min 内不再翻转过去,说明翻正反射恢复；③潜伏期：从注射开始到翻正反射消失所用的时间；④睡眠时间：从翻正反射消失到翻正反射恢复所用的时间。

1.7 戊巴比妥钠阈下催眠量作用的实验

1.7.1 实验方法 各组小鼠灌胃给药1 次/d, 连续7 d, 并于末次给药后1 h, 腹腔注射阈剂量戊巴比妥钠溶液(预实验确定为28 mg/kg) 。

1.7.2 判断指标 小鼠注射戊巴比妥钠后15 min内翻正反射消失, 且翻正反射消失持续时间达1 min以上者为阳性,记录小鼠入睡潜伏期及翻正反射消失持续时间。

1.8 观察指标 比较五组小鼠自主活动次数、睡眠潜伏期时间及睡眠时间、入睡率情况, 并比较其中正常对照组、苏格木勒-4高剂量组、苏格木勒-4中剂量组、苏格木勒-4低剂量组的生化指标。第7天灌胃结束后1 h对小鼠进行麻醉后摘除眼球取血。血液置于1.5 ml EP管中于高速离心机中离心, 取上清液进行生化指标检测。

1.9 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验；多组间比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA)处理实验结果, 首先进行Levene方差齐性检验, 方差齐性且整体比较组间有显著性差异时采用LSD法进行多重比较, 方差分析不显著时不进行多重比较。方差不齐, 采用非参数Kruskal-Wallis检验。计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 五组小鼠自主活动次数比较 采用方差分析, 方差齐,整体比较差异有统计学意义(F=3.442, P=0.012＜0.05), 进一步进行多重比较。每组16只。苏格木勒-4高剂量组、苏格木勒-4中剂量组、苏格木勒-4低剂量组小鼠自主活动次数与正常对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05), 安神补脑液对照组与正常对照组小鼠自主活动次数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 1。

表1 五组小鼠自主活动次数比较( ±s, 次)

表1 五组小鼠自主活动次数比较( ±s, 次)

注：与正常对照组比较, aP<0.05

组别 只数 自主活动数苏格木勒-4高剂量组 16 183.19±66.91a苏格木勒-4中剂量组 16 196.19±46.94a苏格木勒-4低剂量组 16 208.13±48.82a安神补脑液对照组 16 248.63±56.18正常对照组 16 246.06±24.13

2.2 五组小鼠睡眠潜伏期时间比较 睡眠潜伏期采用方差分析, 方差齐, 整体比较差异有统计学意义(F=2.879,P=0.032＜0.05)。每组11只, 其中苏格木勒-4中剂量组有1只未入睡。苏格木勒-4高剂量组与安神补脑液对照组睡眠潜伏期时间明显短于正常对照组, 差异具有统计学意义(P＜0.05), 苏格木勒-4中剂量组与苏格木勒-4低剂量组睡眠潜伏期时间比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 五组小鼠睡眠潜伏期时间比较( ±s, min)

表2 五组小鼠睡眠潜伏期时间比较( ±s, min)

注：与正常对照组比较, aP<0.05

只数 睡眠潜伏期时间组别苏格木勒-4高剂量组 11 8.55±2.98a苏格木勒-4中剂量组 10 9.30±1.43苏格木勒-4低剂量组 11 10.27±1.42安神补脑液对照组 11 7.45±0.58a正常对照组 11 12.55±1.23

2.3 五组小鼠睡眠时间比较 睡眠时间因不符合正态分布, 故用非参数检验, 整体比较差异具有统计学意义(P=0.02＜0.05)。每组16只, 正常对照组10只小鼠；其中苏格木勒-4高剂量组有1只未入睡, 2只死亡；安神补脑液对照组及苏格木勒-4低剂量组各有1只未入睡1只死亡。安神补脑液对照组及苏格木勒-4高剂量组、苏格木勒-4中剂量组、苏格木勒-4低剂量组睡眠时间均长于正常对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 五组小鼠睡眠时间比较( ±s, min)

表3 五组小鼠睡眠时间比较( ±s, min)

注：与正常对照组比较, aP<0.05

组别 只数 睡眠时间苏格木勒-4高剂量组 13 100.62±30.41a苏格木勒-4中剂量组 16 71.69±4.88a苏格木勒-4低剂量组 14 69.93±9.32a安神补脑液对照组 14 67.07±6.38a正常对照组 10 41.10±4.06

2.4 五组小鼠入睡率比较 每组20只, 其中安神补脑液对照组有3只未入睡。安神补脑液对照组及苏格木勒-4高剂量组、苏格木勒-4中剂量组、苏格木勒-4低剂量组入睡率均优于正常对照组, 差异具有统计学意义(P＜0.05), 苏格木勒-4高剂量组入睡率高于苏格木勒-4中剂量组、苏格木勒-4低剂量组、安神补脑液对照组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表 4。

表4 五组小鼠入睡率比较(只, %)

2.5 生化指标检测结果 每组10只。苏格木勒-4高剂量组、苏格木勒-4中剂量组、苏格木勒-4低剂量组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、AST/ALT、血糖(GLU)、谷氨酰转肽酶(GGT)、血尿酸(UA-G)、血肌酐(CRE-G)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IDBIL)指标与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。总胆固醇(CHOL)指标比较差异有统计学意义(P＜0.05), 苏格木勒-4低剂量组与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05), 苏格木勒-4低剂量组与苏格木勒-4中剂量组比较差异有统计学意义(P＜0.05), 其余均无意义。甘油三酯(TG)指标比较总体结果有意义, 但其方差分析不显著, 不进行多重比较。见表5。

表 5 四组小鼠生化检验比较( ±s)

表 5 四组小鼠生化检验比较( ±s)

指标 苏格木勒-4高剂量组(n=10) 苏格木勒-4中剂量组(n=10) 苏格木勒-4低剂量组(n=10) 正常对照组(n=10)ALT(U/L) 46.14±13.78 43.70±8.49 51.43±11.67 38.83±5.23 AST(U/L) 224.50±68.59 204.60±39.68 231.40±70.31 165.50±25.39 AST/ALT 5.04±1.45 4.75±0.82 4.64±1.49 4.38±1.12 GLU(mmol/L) 5.89±1.45 6.24±1.60 5.89±1.59 6.50±1.54 CHOL(mmol/L) 2.41±0.55 2.01±0.46 2.68±0.52 2.19±0.27 TG(mmol/L) 0.83±0.25 1.00±0.26 1.27±0.49 0.99±0.36 GGT(U/L) -1.64±1.87 -1.00±2.79 -1.71±1.64 -1.00±2.97 UA-G(μmol/L) 109.88±47.52 108.51±18.62 110.21±38.56 92.72±27.70 CRE-G(μmol/L) 21.46±67.98 25.57±30.93 13.73±39.51 34.78±16.09 TBIL(μmol/L) 0.43±4.51 0.09±3.68 -0.55±5.26 2.73±2.10 DBIL(μmol/L) 0.43±1.36 0.76±0.20 0.34±1.28 0.92±0.37 IDBIL(μmol/L) 0.00±3.46 -0.67±3.63 -0.89±4.51 1.65±1.86

3 讨论

萨础拉等［3］通过工艺提取白豆蔻-白苣胜挥发油发现其可减少小鼠动时间及小鼠前肢上抬次数, 缩短戊巴比妥所致小鼠入睡的潜伏时间, 延长睡眠持续时间。酸枣仁被认为是中药中最常用的镇静安眠药。在临床的大量应用中, 通过高质量的随机对照试验(RTCs)评估含酸枣仁组分的中药方剂如酸枣仁汤等的疗效及安全性, 分析表明疗效明确, 且总体安全性较高。基于大量药理学实验表明, 酸枣仁各化学组分均有安神宁心, 镇静催眠的作用, 且可能主要通过γ-氨基丁酸(GABA)能和5-羟色胺能系统发挥镇静和催眠作用,项目组还在进行进一步实验确定［4-11］。综上本实验采用的苏格木勒-4味汤在原有君药白豆蔻臣药白苣胜和辅药荜菝的基础上, 再重用酸枣仁, 取得了良好的临床效果。安神补脑液对照组为本实验的阳性对照方, 是临床应用中比较常用且疗效显著地复方中药制剂。目前国内外对安神补脑液从其有效成分的测定到镇静安神作用再到不同工艺其作用的影响及毒理作用都有研究［12-17］。

本实验中镇静作用的代表指标为小鼠自主活动次数, 动物的自主活动情况反映其中枢神经系统的功能状态, 兴奋时活动次数增加, 抑制时活动次数减少, 所以小鼠自主活动实验是评价中枢神经系统兴奋状态的一项重要指标［18］。催眠作用的代表指标为注射戊巴比妥钠后小鼠的睡眠潜伏期时间及睡眠时间。结果表明:①苏格木勒-4高剂量组、苏格木勒-4中剂量组、苏格木勒-4低剂量组小鼠自主活动次数与正常对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05), 表现出较明显的镇静作用。而安神补脑液对照组与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。②苏格木勒-4高剂量组与安神补脑液对照组睡眠潜伏期时间明显短于正常对照组, 差异具有统计学意义(P＜0.05), 苏格木勒-4中剂量组与苏格木勒-4低剂量组睡眠潜伏期时间比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。提示苏格木勒-4对小鼠镇静催眠作用与其剂量相关, 剂量越大,对小鼠镇静催眠作用越强。③苏格木勒-4各剂量组和安神补脑液对照组均能延长阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠的时间, 增强戊巴比妥钠的催眠作用。④与正常对照组相比, 苏格木勒-4各剂量组与安神补脑液对照组均能提高小鼠入睡率, 苏格木勒-4高剂量效果依次高于中剂量、低剂量和安神补脑液对照组。提示苏格木勒-4对小鼠促眠作用与其剂量相关, 剂量越大, 对小鼠促眠作用越强。⑤小鼠生化检测显示, 实验组小鼠与正常小鼠比较肝肾功能未发现明显差异。

本实验结果显示, 苏格木勒-4有明显的镇静催眠作用,高剂量效果尤为明显。本实验目前未与原方进行比较, 没有实验基础和数据支持本方疗效优于原方。未来本课题组将进行这一部分试验, 也将筛选有效部位群进行更深一步的药效及机制研究。

此外, 在注射戊巴比妥钠实验过程中, 因为存在个体差异,所以当给药结束后注射预实验测得阈下阈上剂量时, 仍部分组别的小鼠出现翻正消失或者死亡现象。这类情况在此前实验中也有报道［19］, 所以在以后进行此类研究时, 每组参与实验的小鼠只数要多出几只, 保证样本量避免产生实验误差。

总之, 苏格木勒-4味汤对小鼠有一定程度的镇静催眠作用。