自噬相关蛋白ATG16L1在肠上皮细胞炎症因子表达中的作用*

王嘉正 沈玉洁 张 琮 周明霞 陈颖伟,2,3&

上海交通大学医学院附属新华医院消化内科1(200092) 上海市儿科医学研究所2 上海市小儿消化与营养重点实验室3

背景：自噬相关基因ATG16L1单核苷酸多态性(SNP)与克罗恩病(CD)发病风险密切相关。目的：探讨ATG16L1在肠上皮细胞炎症因子表达中的作用。方法：利用人结肠腺癌细胞株Caco-2构建体外肠上皮细胞模型，予ATG16L1 siRNA干预，并以白细胞介素-1β(IL-1β)诱导炎症因子表达。采用real-time PCR和蛋白质印迹法验证ATG16L1 siRNA转染的有效性，real-time PCR和ELISA法检测Caco-2细胞IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达。结果：研究使用的siRNA能有效抑制ATG16L1表达。IL-1β可诱导Caco-2细胞IL-6、IL-8、MCP-1 mRNA和蛋白表达上调(P<0.05)，沉默ATG16L1可使IL-1β诱导的上述炎症因子表达进一步增高(P<0.05)。结论：在肠上皮细胞中，ATG16L1可负性调控IL-1β诱导的炎症因子表达，在维持肠黏膜免疫系统稳态中发挥重要作用。

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一类主要累及肠道的慢性非特异性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)。目前研究认为IBD是在携带易感基因的遗传背景下，由肠道微生物触发宿主肠道免疫功能紊乱所致[1]。全基因组关联研究(GWAS)发现自噬相关基因ATG16L1(autophagy-related 16-like 1)单核苷酸多态性(SNP)与CD发病风险密切相关[2-4]，该结果近年已在中国人群中得到证实[5]。ATG16L1基因最常见的SNP位点是rs2241880，该位点错义突变导致ATG16L1蛋白第300位苏氨酸(threonine)为丙氨酸(alanine)所取代，以T300A表示。T300A可促进caspase-3和caspase-7介导的ATG16L1蛋白降解，导致细胞内ATG16L1表达降低[6-7]。研究发现ATG16L1缺陷可增强细菌代谢产物诱导的单核/巨噬细胞炎症因子表达[8-9]，但ATG16L1是否能调控肠上皮细胞炎症因子表达，目前尚未见相关报道。本研究以白细胞介素-1β(IL-1β)作用于肠上皮细胞模拟肠道炎症状态，并以RNA干扰技术沉默ATG16L1，旨在探讨ATG16L1在肠上皮细胞炎症因子表达中的作用，以期为阐明CD发病机制提供新思路。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人结肠腺癌细胞株Caco-2购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由上海市儿科医学 研究所保存。Transwell小室、DMEM培养基(Corning Incorporated)；胎牛血清、非必需氨基酸、青/链霉素、Opti-MEMTM减血清培养基、TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific)；HiPerFect转染试剂(QIAGEN)；IL-1β(PeproTech, Inc)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara Bio Inc.)；HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)； ATG16L1抗体(Abcam plc.)；IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)ELISA试剂盒(上海达科为生物技术有限公司)。ATG16L1 siRNA、阴性对照(negative control, NC)siRNA由广州锐博生物技术有限公司合成，ATG16L1 siRNA靶序列：5’-GGA TCC AGT TGC AAT GAT A-3’。

二、方法

1. 体外肠上皮细胞模型建立：将Caco-2细胞以3×104/cm2的密度接种于Transwell小室中，加入含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基，隔日换液。细胞培养10～14 d后，通过监测跨上皮细胞电阻(transepithelial electrical resistance, TEER)判断细胞分化程度。测定TEER时以HBSS替换Transwell小室内、外培养基，于37 ℃细胞培养箱中静置30 min。Transwell小室膜具有一定电阻，因此应分别测定空白小室和接种细胞小室的电阻。TEER=(接种细胞小室电阻-空白小室电阻)×小室底面积，单位为Ωcm2。TEER≥ 400 Ωcm2可认为Caco-2细胞分化成熟，体外肠上皮细胞模型构建成功。

2. 细胞转染：转染前将培养基更换为Opti-MEMTM减血清培养基。在1.5 mL离心管中依次加入Opti-MEMTM减血清培养基、NC siRNA/ATG16L1 siRNA和HiPerFect转染试剂，混匀静置15 min后加入培养基中。6 h后将减血清培养基更换为含血清DMEM完全培养基，培养24 h后检测目的基因mRNA表达，48 h后检测目的蛋白表达。

3. Real-time PCR：分化成熟的Caco-2细胞分别转染NC siRNA和ATG16L1 siRNA 24 h后，每组进一步分为两组，予10 ng/mL IL-1β处理3 h或不予处理，即分为NC siRNA组、NC siRNA+IL-1β组、ATG16L1 siRNA组和ATG16L1+IL-1β组四组。 TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，以之为模板行PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应体系10 μL，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，循环40次。2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。实验独立重复3次。

表1 Real-time PCR目的基因引物序列

4. 蛋白质印迹法：分化成熟的Caco-2细胞分别转染NC siRNA和ATG16L1 siRNA 48 h后，加入100 μL含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白。取20 μg总蛋白行聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白转印至PVDF膜，室温封闭1 h，加入ATG16L1抗体(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h；ECL显色，凝胶成像系统进行图像分析。

5. ELISA：实验分组同real-time PCR，siRNA转染时间为48 h，IL-1β处理时间为24 h。收集细胞培养基，将培养基与稀释好的标准品加入反应孔(100 μl/孔)，随后加入一抗(50 μl/孔)，37 ℃孵育2 h；洗涤3次，印干；加入二抗(100 μl/孔)，37 ℃孵育1 h；洗涤3次，印干；加入底物(100 μl/孔)，37 ℃避光孵育5～10 min；加入终止液(100 μl/孔)。使用酶标仪读取波长450 nm处吸光度(A)值。根据标准品浓度及其对应的A值绘制标准曲线，计算样品IL-6、IL-8、MCP-1浓度。每组设3个复孔，实验重复3次。

三、统计学分析

结 果

一、ATG16L1 siRNA有效性验证

与NC siRNA组相比，ATG16L1 siRNA组Caco-2细胞ATG16L1 mRNA和蛋白表达明显降低， 差异有统计学意义(P<0.05)，证明研究使用的siRNA能有效抑制ATG16L1表达(图1)。

图1Caco-2细胞转染ATG16L1siRNA后ATG16L1mRNA和蛋白表达

二、ATG16L1对IL-1β诱导的炎症因子表达的影响

与NC siRNA组相比，NC siRNA+IL-1β组Caco-2细胞IL-6、IL-8、MCP-1 mRNA和蛋白表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明IL-1β可诱导肠上皮细胞炎症因子表达；与NC siRNA+IL-1β组相比，ATG16L1 siRNA+IL-1β组上述炎症因子mRNA和蛋白表达进一步增高(P<0.05)，表明ATG16L1可抑制IL-1β诱导的肠上皮细胞炎症因子表达(图2)。

图2 沉默ATG16L1对IL-1β诱导的Caco-2细胞炎症因子表达的影响

讨 论

自噬是细胞的一种代谢过程。在细胞内、外信号的刺激下，细胞质中产生双层膜结构，将胞内大分子蛋白或细胞器包裹形成自噬体，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并对内容物进行分解，为细胞提供能量来源和物质合成的原料，在维持细胞稳态方面发挥重要作用[10]。随着自噬相关基因ATG16L1被发现是CD易感基因，自噬在CD发生中的作用开始受到关注，为CD发病机制的研究提供了新的方向。

ATG16L1缺陷的细胞，自噬体形成和蛋白降解受到严重影响。Saitoh等[8]的研究以脂多糖刺激ATG16L1缺陷的巨噬细胞，发现促炎细胞因子IL-1β、IL-18表达显著增加。其后Plantinga等[9]使用NOD2配体胞壁酰二肽刺激携带ATG16L1突变(T300A)CD患者的外周血单个核细胞，亦发现IL-1β、IL-6分泌显著增加。上述结果表明在单核/巨噬细胞中，ATG16L1发挥抑制炎症因子表达和免疫炎症反应的作用，而ATG16L1缺陷引起的IL-1β分泌异常可能是导致CD发生的原因之一。本研究发现，在Caco-2体外肠上皮细胞模型中，以RNA干扰技术沉默ATG16L1可显著上调IL-1β诱导的炎症因子IL-6、IL-8、MCP-1表达，证实ATG16L1在肠上皮细胞中亦发挥负性调控炎症因子表达的作用。除调控炎症因子表达外，ATG16L1在抗菌免疫方面也发挥重要作用。Cadwell等[11]发现ATG16L1缺陷Paneth细胞的颗粒胞吐途径出现异常，表现为溶菌酶释放减少，该现象在携带ATG16L1突变的CD患者肠道组织中得到证实，表现为颗粒排列紊乱、消失或胞质内溶酶体弥漫染色的Paneth细胞比例增加。此外，Conway等[12]发现ATG16L1对于肠上皮细胞清除沙门菌感染至关重要。

尽管ATG16L1对炎症因子的调控作用已得到证实，但其内在机制有待阐明。研究发现ATG16L1通过与ATG5和ATG12形成复合物，促进ATG8/LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)与磷脂酰乙醇胺结合[13]，该过程对于形成完整的自噬体至关重要。ATG16L1表达减少将影响自噬体形成，进而导致通过自噬降解的蛋白质在细胞内积聚。有研究发现敲除ATG16L1可引起p62蛋白表达增加[8,12]。p62是一种多功能蛋白，一方面其可与自噬效应蛋白LC3结合，使p62-LC3阳性小体通过自噬过程被降解[14]，另一方面还可参与调控细胞内信号转导。p62通过与肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)结合，调节NF-κB抑制蛋白激酶(IKK)活性[15]。而IKK通过磷酸化NF-κB抑制蛋白(IκB)解除其对NF-κB的抑制作用，促进NF-κB入核启动靶基因转录[16]。研究发现IL-1β可激活NF-κB，肠上皮细胞中的炎症因子如IL-6、IL-8、MCP-1等的表达受NF-κB调控[17-18]。由此推测，在ATG16L1基因突变(T300A)的遗传背景下，肠上皮细胞自噬过程受抑，p62因降解受阻而在细胞内积聚，促进NF-κB激活，进而增加其下游炎症因子表达。

综上所述，在肠上皮细胞中，ATG16L1可负性调控IL-1β诱导的炎症因子表达，在维持肠黏膜免疫系统稳态中发挥重要作用，该过程可能是通过促进p62降解、抑制NF-κB激活实现的。在ATG16L1基因多态性的遗传背景下，自噬过程异常引起的炎症因子分泌紊乱和抗菌免疫受损可能是CD发生的原因。通过改善肠上皮细胞的自噬状态抑制炎症因子表达有望成为治疗CD的新方法。