赤霞珠葡萄酒生产废弃物资源化利用*

毛建利李 艳

1（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）1（河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

我国是世界上葡萄酒生产大国，年产量达到100多万千升，约剩余20万吨皮渣，其中分离葡萄籽6万吨、葡萄皮10万吨、葡萄梗4万吨，这些皮渣大多被用于生产饲料、肥料或者做填埋处理，利用率极低，不仅造成资源浪费，也给生态环境造成了一定破坏。

Harman在20世纪50年代中期第一次提出了衰老自由基学说，认为衰老是细胞内成分被氧自由基损害而造成的，维持体内正常水平的自由基，可以延缓人体细胞的衰老。研究还发现，目前威胁着人体健康的癌症、帕金森综合征、糖尿病和艾滋病等多种重大疾病，都与生物大分子的氧化损伤有关。

单宁是一类水溶性多元酚化合物，分子量在500 Da～3 000 Da之间，性质活泼，单宁的酚羟基与苯环直接相连的化学结构使其具有很好的抗氧化活性。单宁在葡萄梗中含量较多，缩合单宁中最有代表性的原花青素是所发现的有效的自由基清除剂之一,对多种疾病具有直接或间接的预防治疗作用。本研究通过对葡萄梗中单宁的提取及抗氧化性研究，为今后这些资源的利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

昌黎产区赤霞珠葡萄酿酒废弃物，包括葡萄皮、葡萄梗、葡萄籽；石家庄地区产巨峰葡萄酿酒废弃物，包括葡萄皮、葡萄梗、葡萄籽。采用传统工艺酿制葡萄酒后的皮渣，经55℃烘干，磨粉，过40目筛，备用。

1.2 仪器与设备

SP-756紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；101-0AB电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；DELTA 320pH数字酸度计，梅普勒-托利多仪器有限公司；JJ1000电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；SHZ-HI真空泵，上海知信实验仪器技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单宁成分测定

单宁（以单宁酸计）：采用福林-丹尼斯法测定。

1.3.2 花色苷含量的测定

称取1.5 g样品溶于20 mL体积浓度60%的酸化乙醇溶液（盐酸体积浓度为0.5%），50℃水浴3 h离心得到上清液。再加入15 mL酸化乙醇，50℃水浴3 h离心取上清液，重复第3次，合并3次上清液定容50mL备用，采用pH值示差法测定。

1.3.3 原料的选择

分别称取10 g不同样品于250mL瓶中，加水50mL放入60℃水浴锅中12 h，将清液滤至250mL容量瓶中；残渣加入30mL热水，80℃水浴20min，清液滤入容量瓶；残渣再加30mL热水，80℃水浴20min重复3～4次，直至提取液与10 g/L三氯化铁溶液不生成蓝色产物为止。定容至刻度，采用福林-丹尼斯方法测定提取液中单宁的含量，求出样品中单宁的质量分数即为样品中单宁的提取得率。

1.3.4 提取剂的选择

分别选取去离子水、体积浓度50%乙醇溶液，体积浓度50%丙酮溶液作为提取剂，葡萄皮渣粉按料液比为1 g∶25mL置于试剂瓶中密封，于60℃恒温水浴中提取6 h，测定提取液中单宁提取得率。

1.3.5 单因素试验

以料液比、提取温度、提取时间和丙酮体积浓度为变化因素，以单宁提取得率为评价指标进行单因素试验。料液比分别为：1 g∶15mL、1 g∶20mL、1 g∶25mL、1g∶30mL、1g∶35mL；温度为：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃；提取时间为：4 h、5 h、6 h、7 h、8 h；丙酮体积浓度设定为：30%、40%、50%、60%、70%。

1.3.6 正交试验优化单宁的提取工艺

在单因素试验基础上，采用L9（34）正交设计，优化单宁的提取工艺。

1.3.7 抗氧化性能

1.3.7.1 ABTS自由基清除试验清除ABTS自由基能力测定采用分光光度法。

式中：A0——不加样品时的吸光度；

A——加入不同量样品时的吸光度。

样品溶液：取1mL提取液，用提取溶剂稀释成与Vc溶液同等浓度的溶液。

Vc溶液：用去离子水配制成质量浓度为80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120 μg/mL、140 μg/mL、160μg/mL的溶液。

取4mL ABTS+·工作液，加入100μL样品溶液，混匀反应6min，黑暗环境下放置6min后于734 nm下测定吸光值，记为A。用提取剂替代样品溶液的记为A0。

1.3.7.2 DPPH自由基清除试验

清除DPPH自由基能力的测定采用分光光度法。

式中：A空白——不加样品时的吸光度；

A样品——加入不同量的样品时的吸光度。

样品溶液：取1mL提取液，用提取溶剂稀释成与Vc同等浓度的溶液。

Vc溶液：用去离子水配制质量浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL的溶液。

分别吸取2mL的样品溶液和Vc溶液于试管中，加入2mLDPPH溶液，每个样品做3个平行对照，摇匀后避光，室温放置30min，517 nm下测定吸光值，记为A样品。用2mL提取溶剂代替样品溶液，吸光值记为A空白。

1.3.7.3 铁离子还原能力的测定铁离子还原能力的测定采用分光光度法：

式中：A0—加入样品和试剂时的吸光度；

A1—不加样品时的吸光度。

样品溶液：取1mL提取液，用提取溶剂稀释成与Vc同等浓度的溶液。

Vc溶液：用去离子水配制质量浓度为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、120μg/mL、140μg/mL的溶液。

吸取2.5mL磷酸盐缓冲溶液、2.5mL铁氰化钾溶液以及不同质量浓度的2.5mL样品溶液，充分混匀。50℃水浴20min后快速冷却，加2.5mL三氯乙酸混匀，3 000 r/min离心10min，取上清液2.5mL，加2.5mL体积分数0.1%的氯化铁溶液，反应10min后在700 nm波长下测定吸光值（A0）。用同等体积的提取溶剂替代样品溶液，测定吸光度A1。

1.3.7.4 羟自由基清除能力的测定

羟基清除能力的测定采用分光光度法：

式中：A1——加入样品和羟基母体溶液时的吸光度；

A2——不加入羟基母体溶液时的吸光度；

A0——只加入羟基母体溶液时的吸光度。

样品溶液：取1mL提取液，用去离子水稀释成与Vc同等浓度的溶液。

Vc溶液：用去离子水配制质量浓度为0.05mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.3mg/mL的溶液。

取3 mL的羟基母体溶液，分别加入1 mL不同浓度的样品溶液，充分混匀，37℃恒温水浴15min，用分光光度计在530 nm测定各组的吸光值A1（分光光度计校零时用去离子水），将羟基母体溶液用等量的提取溶剂代替，吸光值记为A2，将样品溶液用等量的提取溶剂代替，吸光值记为A0。

1.3.8 数据处理

采用Excel 2003、Origin8.5、SPSS18.0进行试验数据的汇总与统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒废弃物单宁提取得率

研究了不同品种葡萄酿酒废弃物各组织的单宁提取得率，结果见图1。

图1 葡萄废弃物中单宁的提取得率

由图1可知，不同品种葡萄酿酒废弃物的单宁提取得率差异显著，且同一品种的葡萄酿酒废弃物各组织之间的单宁提取得率也有显著差异。其中赤霞珠葡萄梗的单宁提取得率达到了8.14%，巨峰梗的单宁提取得率达到了7.21%。

2.2 葡萄酒废弃物中花色苷的提取得率

研究了不同品种葡萄酿酒废弃物各组织的花色苷提取得率，结果见下页图2。

由图2可知，不同品种葡萄酿酒废弃物的花色苷提取得率差异显著，同一品种不同组织部位的花色苷提取得率差异性不显著。其中赤霞珠葡萄皮和赤霞珠葡萄籽的花色苷提取得率最高，均为0.10%。巨峰葡萄梗和皮的差异性呈现显著性，其提取得率分别为0.022%和0.018%。根据上述数据，后续试验选择赤霞珠葡萄梗作为提取原料。

2.3 提取剂的选择

选择水、体积浓度50%乙醇溶液、体积浓度50%丙酮溶液为试剂，以葡萄梗为原料提取单宁，结果如图3所示。

图2 样品花色苷的提取得率

图3 不同提取剂对赤霞珠葡萄梗中单宁的提取得率

图4 赤霞珠葡萄梗中单宁提取条件的单因素试验

由图3可知，不同的提取剂对赤霞珠葡萄梗中单宁的提取得率差异显著，其中体积浓度50%的丙酮对赤霞珠葡萄梗的单宁提取得率最高为7.75%。不同的溶剂极性不同，单宁的溶解率变化很大，水的提取得率最低为5.56%。因此选用提取得率较高的丙酮作为优化提取赤霞珠葡萄梗的提取剂。

2.4 赤霞珠葡萄梗中单宁提取的单因素试验

分别进行料液比、提取温度、提取时间、丙酮体积浓度对单宁提取率的影响单因素试验，结果见图4。

从图4看，在料液比1 g∶25mL附近，单宁的提取得率最高，为7.75%，继续提高料液比，提取率没有明显增加。在浸提过程中，温度会影响分子运动的速率，随着温度提高，可溶性物质分子运动加剧，单宁迅速渗出、溶解和扩散至溶液中，60℃时单宁提取得率最高，到70℃时降低，温度过高会破坏单宁或加速单宁的氧化分解。在恒定温度下，提取时间延长会促使物质溶出，因此呈现上升趋势，达到高峰值后下降，提取6 h时单宁的提取得率最高，时间再长导致提取液中单宁成分在较高温度下被破坏。丙酮体积浓度的改变，会影响到提取剂的极性，从而改变单宁的溶解度，单宁在体积分数50%的丙酮溶剂中提取得率最高。

2.5 赤霞珠葡萄梗中单宁提取正交试验

根据单因素试验结果，通过正交设计对赤霞珠葡萄梗中单宁提取条件进行优化。因素水平见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验优化葡萄梗中单宁的提取条件

由表2可知，各因素的极差大小顺序为A＞B＞C＞D，由此可得出，影响赤霞珠葡萄梗中单宁提取率的4个因素先后顺序为：料液比＞温度＞时间＞丙酮体积浓度，最优的提取工艺条件为：A2B2C2D2，即料液比1 g∶25mL，提取温度60℃，提取时间6 h，丙酮体积浓度为50%。

在最优正交试验条件下，进行验证和拟合试验，试验平行3次求得平均值，单宁的平均提取得率为7.75%，比正交表中最佳提取得率提高6.71%。

2.6 赤霞珠葡萄梗中单宁提取物体外抗氧化试验

2.6.1 赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对ABTS自由基的清除试验

以Vc为对照，研究赤霞珠葡萄梗单宁提取液对ABTS自由基的清除率，对比效果见图5。

图5 赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对ABTS自由基的清除试验

由图5可知，单宁提取物对ABTS自由基的清除能力明显高于Vc。Vc质量浓度在90μg/mL，对ABTS自由基的清除率达到了50.92%，而单宁提取物在此浓度下对ABTS自由基的清除率达到了90.01%。当单宁提取物的质量浓度达到了110μg/mL时，对ABTS自由基的清除率就能达到100%。由试验结果分析可知，赤霞珠葡萄梗单宁提取物对ABTS自由基的清除效果明显。

2.6.2 赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对DPPH自由基的清除试验

以Vc为对照研究赤霞珠葡萄梗单宁提取液对DPPH自由基的清除率，对比效果见图6。

图6 赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对DPPH自由基的清除试验

由图6可知，赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对DPPH自由基的清除能力要明显高于Vc。当Vc的质量浓度为30μg/mL，对DPPH自由基的清除率达到了48.30%，而同等浓度的单宁提取液对DPPH自由基的清除率达到了97.00%。当单宁质量浓度增加到40μg/mL时，其对DPPH自由基的清除率就能达到100%。由试验结果分析可知，赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对DPPH自由基的清除效果明显。

2.6.3 赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对铁离子的还原能力试验

以Vc为对照，研究赤霞珠葡萄梗中单宁提取液对铁离子还原能力，对比效果见图7。

图7 赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对铁离子的清除试验

由图7可知，赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对铁离子的还原能力略低于Vc。当Vc的质量浓度为10μg/mL时，对铁离子的清除率为55.46%，同等浓度下的单宁提取物对铁离子的清除率为52.24%。随着Vc和单宁提取物质量浓度的增加，对铁离子的还原能力也明显增加。由试验结果分析可知，赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对铁离子的还原效果良好。

2.6.4 赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对羟自由基的清除试验

以Vc为对照,研究赤霞珠葡萄梗中单宁提取液对羟自由基的清除率，对比效果见图8。

由图8可知赤霞珠葡萄梗中的单宁提取物对羟自由基的清除能力略弱于Vc。当Vc质量浓度为0.25 mg/mL时，对羟自由基的清除率达到了54.44%，同等浓度下的单宁提取液对羟自由基的清除率也达到了50.12%。随着Vc和单宁提取液质量浓度的增加，对羟自由基的清除率都呈现上升的趋势。由试验结果分析可知，赤霞珠葡萄梗对羟自由基的清除作用明显。

3 结论

图8 赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对羟自由基的清除试验

a）不同品种的葡萄酿酒废弃物的单宁提取得率差异显著，同一品种的葡萄酿酒废弃物各组织之间的单宁提取得率差异也显著。其中葡萄梗的单宁提取得率最高，赤霞珠葡萄梗的单宁提取得率为8.14%，巨峰葡萄梗的单宁提取得率为7.21%。

b） 在正交试验最优条件下，即：料液比为1∶25（g/mL），提取温度60℃，丙酮浓度为50%，浸提时间为6 h，进行验证和拟合试验，试验平行3次求得平均值，单宁的平均提取得率为7.75%。

c）试验结果分析可知，以Vc为阳性对照并对赤霞珠葡萄中的单宁提取液进行ABTS、DPPH、羟自由基、铁离子的清除试验，明显看出赤霞珠葡萄梗中单宁提取物对4种自由基的清除效果良好，由此说明赤霞珠葡萄梗具有开发抗氧化产品的潜力。