响应面法优化卡布里鹰嘴豆蛋白提取工艺

张俊杰,郭 晨,刘毅飞,方 彩,王志伟,王义虬,纵 伟,2,*

(1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院,河南郑州 450002; 2.食品生产与安全河南省协同创新中心,河南郑州 450002; 3.河南省冷链食品质量安全控制重点实验室,河南郑州 450002)

鹰嘴豆(CiceraritienumL.)是豆科(Leguminosae)鹰嘴豆属(Cicer)唯一栽培种[1],世界第二大种植豆类,仅次于大豆[2],也是世界第三大作为膳食蛋白质来源的豆类作物[3],已经有几千年的栽培历史[4]。鹰嘴豆是一种天然植物蛋白资源,蛋白质含量占籽粒干基总量的13%～33%[5],贮藏蛋白主要由清蛋白、球蛋白和谷蛋白组成[6]。鹰嘴豆含有18种氨基酸,包括人体必需的8种氨基酸[7]。鹰嘴豆蛋白因其氨基酸组成均衡、生物利用率高和抗营养因子低而被作为植物蛋白的重要来源[8],且鹰嘴豆蛋白本身就具有一定的抗氧化活性[9],是一种非常好的全价蛋白[10]。

卡布里鹰嘴豆的传统种植区是在地中海沿岸和中亚地区[11]。我国鹰嘴豆主要分布于新疆、青海、甘肃和云南等省[12],其中,新疆的木垒县和奇台县是我国鹰嘴豆的主产区[13]。该地区根瘤菌的遗传多样性已被充分研究。根瘤菌可以与鹰嘴豆共生固氮,进一步影响鹰嘴豆籽粒品质,如蛋白质含量等。而云南文山地区是首次引种卡布里鹰嘴豆,对其籽粒中蛋白尚未见相关研究报道。

综合国内外对于蛋白质提取的研究,普遍采用的方法有溶液提取法、酶提取法、超声波提取法和双水相萃取法[14]。碱溶酸沉法是溶液提取法的一种,主要是利用蛋白质在等电点(Isoelectric point,pI)溶解度最小的原理,在pH较高时溶解蛋白,然后调节pH至pI使之凝聚沉淀[15]。该法具有操作简单、易于控制、成本低廉等优点[16]。之前周丽卿等[17]以新疆鹰嘴豆为原料探究了其蛋白质的最佳提取工艺参数,但尚未对其蛋白纯度进行研究。

本文以云南文山卡布里鹰嘴豆为原料,采用碱溶酸沉法提取鹰嘴豆蛋白,并进一步优化了蛋白提取工艺,同时保证了高蛋白得率与高蛋白纯度,旨在为云南地区鹰嘴豆的推广种植与综合利用提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

卡布里鹰嘴豆 云南文山自治州丘北县;氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、硼酸、溴甲酚绿、甲基红、石油醚(沸程60～90 ℃) 分析纯,天津市永大化学试剂有限公司。

400Y粉碎机 浙江金华铂欧五金厂;TGL-20M台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;AE224电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;250 mL索氏抽提器 郑州中天实验仪器有限公司;101-2电热鼓风干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司;T6新世纪紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;HYP-3智能消化炉、KDN-103F型自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 粉碎 选择成熟且颗粒饱满的鹰嘴豆籽粒,用粉碎机以30000 r/min的转速粉碎,过100目筛。将过筛的豆粉放入烘箱中，40 ℃烘干至恒重,装入自封袋4 ℃保存备用。

1.2.2 脱脂 索氏抽提参照国家标准GB/T 5009.6-2003[18]。将干燥至恒重的豆粉用滤纸包好放入索氏抽提器中,以沸程为60～90 ℃的石油醚为提取剂进行脱脂。抽提温度80 ℃,抽提时间8 h,至抽提器中石油醚由黄色变为透明无色,以保证脱脂完全。脱脂后的豆粉放于烘箱中，40 ℃进行干燥至恒重,装入自封袋4 ℃保存备用。

1.2.3 等电点的测定 Sanchez-Vioque等[19]测定了鹰嘴豆总蛋白的等电点为4.3,初步判断云南卡布里鹰嘴豆的等电点主要在4～5之间。采用紫外分光光度法测定。称取0.5 g脱脂豆粉9份,制备碱溶上清液10 mL,用5 mol/L HCl溶液调节pH分别为3.5、4.0、4.1、4.3、4.5、4.7、4.9、5.0、5.5,6000 r/min 离心15 min,分别吸取1 mL上清液,在595 nm处比色测定吸光值[20]。上清液吸光度最低,即残留蛋白最少,所对应的pH为蛋白的等电点。

1.2.4 卡布里鹰嘴豆蛋白的提取 用文献[21]中报道的方法并做适当修改,从云南卡布里鹰嘴豆中提取蛋白。称取脱脂后的豆粉3 g置于锥形瓶中,分别编号,按照一定比例加入蒸馏水,摇匀后滴加0.5 mol/L的NaOH溶液调节pH,搅拌溶解一定时间后,将溶液转移到离心管中进行离心,在6000 r/min的转速下离心15 min。离心完毕,取上清液倾倒于前一步的锥形瓶中。然后用0.5 mol/L HCl溶液调节上清液pH至鹰嘴豆蛋白等电点4.9,继续在6000 r/min的转速下离心15 min。之后将上清液倾倒干净,所得沉淀物即为云南卡布里鹰嘴豆蛋白粗提物。

1.2.5 单因素实验 按照上述步骤,以提取鹰嘴豆蛋白的液料比、碱溶pH、碱溶温度、碱溶时间为试验因素,以鹰嘴豆粗蛋白得率作为试验指标,分别做单因素实验,以分析各因素对鹰嘴豆蛋白得率的影响。

以液料比为单因素时,在碱溶温度40 ℃,碱溶时间30 min,碱溶pH9.5,酸沉pH4.9的条件下,将液料比梯度分别设置为8∶1、10∶1、12∶1、14∶1和16∶1 mL/g提取蛋白质。

以碱溶pH为单因素时,在液料比12∶1 mL/g,碱溶温度40 ℃,碱溶时间30 min,酸沉pH4.9的条件下,将碱溶pH梯度设置为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0提取蛋白质。

以碱溶温度为单因素时,在液料比12∶1 mL/g,碱溶pH9.5,碱溶时间30 min,酸沉pH4.9的条件下,将碱溶温度梯度设置为20、30、40、50、60 ℃提取蛋白质。

以碱溶时间为单因素时,在液料比12∶1 mL/g,碱溶pH9.5,碱溶温度40 ℃,酸沉pH4.9的条件下,将碱溶时间梯度设置为30、60、90、120、150 min提取蛋白质。

1.2.6 响应面试验 在单因素实验的基础上,选取碱溶pH、液料比和碱溶时间三个因素,每个因素中选取三个对蛋白质得率影响较大的水平,建立三因素三水平的Box-Behnken中心组合试验,以蛋白质得率为响应值,各因素的三个水平采用-1、0、1进行编码,如表1。每个试验组合重复测定2次,取其平均值作为得率结果,试验结果采用Design-Expert 8.0.6.1软件分析。

表1 Box-Behnken 实验设计因素及水平表Table 1 Variables and levels for Box-Behnken design

1.2.7 计算公式 对采用碱溶酸沉法最终产物蛋白质得率按照以下公式计算。

蛋白质得率(%)=提取出粗蛋白质的质量/脱脂豆粉的质量×100

鹰嘴豆粉纯度测定按照国家标准GB5009.5-2016[22]计算,采用凯氏定氮法进行,氮含量换算蛋白质含量的换算系数:6.25。计算公式如下:

纯度(%)(干基)=[(V2-V1)×(N×0.0140×K×100)]/[W×(100-X)×100]

式中:V2-滴定试样时消耗酸标准溶液的体积(mL);V1-滴定试样时消耗酸标准溶液的体积(mL);N-酸标准溶液的当量浓度,N;K-氮换算成粗蛋白质的系数;W-试样质量(g);X-试样水分含量;0.0140-每毫克当量氮的克数。

1.2.8 数据处理 利用OriginPro 9.0、Design-Expert 8.0.6 Trial和SPSS Statistics 17.0.0.236进行数据处理及分析。

2 结果与分析

2.1 鹰嘴豆脱脂蛋白等电点测定结果

从图1可以看出,在所测的pH范围内,随着pH的增大,上清液的吸光度呈现出先减小后增大的趋势。在pH为4.9处,上清液的吸光度最小,表明了上清液中所残留的蛋白质浓度最低,该pH即为鹰嘴豆蛋白质的等电点。与张涛等[23]报道的鹰嘴豆分离蛋白等电点pI=5相似。

图1 吸光度随pH变化曲线Fig.1 Absorbency with pH change curves

2.2 单因素试验结果

2.2.1 液料比对鹰嘴豆蛋白质得率的影响 由图2可得,蛋白质得率基本在10.50%左右,并随着加水量的增加先增大,在液料比为12∶1 mL/g时得率为最大,达到10.69%,之后得率逐渐减小。这是由于适当增加液料比有助于增加蛋白质的溶出量,提高得率;但液料比过大,蛋白质分子与水分子之间相互作用增加,使蛋白质分子之间不容易发生聚沉,在酸沉时会导致蛋白质流失到上清液中,反而造成蛋白质损失[20],从而降低得率。综合考虑,提取鹰嘴豆蛋白质的最佳液料比为12∶1 mL/g。

图2 液料比对鹰嘴豆蛋白质得率的影响Fig.2 Effect of ratio of water to material on the yield of Chickpea protein

2.2.2 碱溶pH对鹰嘴豆蛋白质得率的影响 由图3可见,随着pH的升高,蛋白质得率逐渐提高,由10.34%一直上升到了12.48%,在碱溶pH为10时达到峰值。但碱溶pH大于10时,蛋白质得率急剧下降,这符合一般植物蛋白在不同pH下的溶解规律。随着碱溶pH的升高,有利于蛋白质在碱性条件下溶解,从而得率升高;但是过高的pH会使蛋白质对水的亲和性增加,从而一部分非水溶性蛋白转变为水溶性蛋白,同时,过高的pH改变了蛋白质分子表面的带电荷状况,引起脱羧、脱氨、胱赖反应、肽键断裂等[24],在两个因素的综合作用下导致了高pH下蛋白质得率急剧降低。所以最佳碱溶pH为10.0。

图3 碱溶pH对鹰嘴豆蛋白质得率的影响Fig.3 Alkali soluble pH value on yield of Chickpea protein

2.2.3 碱溶温度对鹰嘴豆蛋白质得率的影响 由图4可知,鹰嘴豆蛋白的得率在碱溶温度较低时随温度的升高而增大,20～30 ℃得率升高明显,由10.22%上升到了11.89%,在40 ℃时得率达到最高,为12.04%。继续升高温度时,蛋白得率反而下降,在60 ℃时降到了9.04%。得率升高是由于温度增加,蛋白质的分子构象轻微改变,分子的立体结构伸展,有利于蛋白质分子和水分子的运动及其相互作用,温度起到增溶作用[25]。蛋白质得率从40 ℃后开始下降,这是因为水分子的热运动加剧使得蛋白质结构展开,维持蛋白质空间构象的次级键被破坏,非极性基团的暴露,导致蛋白质分子间发生聚集和沉淀,造成了得率降低[26]。因此确定最佳碱溶温度为40 ℃。

图4 碱溶温度对鹰嘴豆蛋白质得率的影响Fig.4 Alkali soluble temperature on yield of Chickpea protein

2.2.4 碱溶时间对鹰嘴豆蛋白质得率的影响 由图5可知,在其它条件相同的情况下,蛋白质溶解度会随着时间延长略有增加,碱溶时间从30 min增加到90 min,得率也由9.04%增加到了9.77%。但溶液达到饱和后,增加碱溶时间对蛋白质得率的提高并不是很明显,甚至还略微有所下降,当碱溶时间达150 min时,得率又降低至9.16%。这是由于溶解一定时间后,蛋白的溶出达到饱和,溶出率趋于平衡,若再进一步延长碱溶时间,可能因为长时间的搅拌导致部分蛋白质变性,从而使得率降低，或者是鹰嘴豆淀粉与蛋白质发生结合,导致蛋白质难以溶出[20]。因此,最佳碱溶时间为得率最高的90 min。

图5 碱溶时间对鹰嘴豆蛋白质得率的影响Fig.5 Alkali soluble time on yield of Chickpea protein

2.3 响应面实验结果

2.3.1 回归模型的建立及显著性检验 根据单因素试验结果,由Design-Expert 8.0.6 Trial统计分析软件设计出的试验方案及结果见表2。以鹰嘴豆蛋白得率为响应值,以碱溶pH(A)、液料比(B)、碱溶时间(C)为自变量,建立三因素三水平中心组合试验设计,共包括17个试验方案。

对表2试验结果进行多元回归拟合,得鹰嘴豆蛋白质得率对pH(A)、液料比(B)和提取时间(C)的二次多项式回归模型为:

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Experimental design and results for response surface experiment

Y=-49.32175+12.57250A+1.08912B-0.14126C+0.24875AB+9.91667×10-3AC+3.33333×10-4BC-0.83600A2-0.15087B2+2.46111×10-4C2

从表3可知,以蛋白质得率为响应值时,模型p<0.0001,表明该二次方程模型极显著。同时失拟项p=0.0611>0.05,失拟项不显著,说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小,可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析[27]。其方程的决定系数R2=0.9927,表明有99.27%的数据可用此方程解释。本实验的CV值为0.72%,说明其置信度较高,模型方程能够较好地反映真实的试验值,可用此模型分析响应值的变化[28-29]。由表4还可以看出,A、C、AB、AC、A2、B2、C2对鹰嘴豆蛋白质得率的影响极显著(p<0.01),B、BC对鹰嘴豆蛋白质得率的影响不显著(p>0.05)。影响蛋白质得率的主次因素依次为A>C>B,即碱溶pH>碱溶时间>液料比。

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.2 响应曲面分析 由图6a可知,碱溶时间为90 min时,随着碱溶pH的升高,在低液料比下,蛋白质得率呈增大趋势,但在高液料比下,蛋白质得率却呈现出下降趋势,这与液料比与pH之间负交互作用高度显著有关。由图6b可以看出,液料比为12∶1 mL/g,在碱溶时间为较低水平时,蛋白质得率随着pH升高呈先升高后降低趋势。

图6 两因素及其交互作用响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of threeprocess parameters on the extraction rate of chickpea protein注：固定水平:碱溶pH10,液料比12∶1 mL/g,碱溶时间90 min。

2.3.3 验证实验 通过软件分析计算得出理论最佳提取工艺:碱溶pH10.02,液料比12.00∶1 mL/g和碱溶时间120.00 min,鹰嘴豆蛋白理论得率可达12.97%。进行验证实验时，为方便实际操作将碱溶pH定为10,其余条件不变,对优化参数进行3次平行验证实验,得鹰嘴豆蛋白平均得率为12.66±0.14%,与理论值相差2.39%，误差较小说明实验可行。

2.4 与已知优化方法的比较

周丽卿等[20]对新疆鹰嘴豆进行过蛋白质提取条件的优化,与本优化条件差异明显。本优化条件中的液料比和碱溶pH分别为12.00∶1 mL/g与10.00,相较于参考方法中的17.70∶1 mL/g与11.00明显降低;而本优化条件中的碱溶温度和碱溶时间分别为40 ℃与120.00 min,则显著高于参考方法中的20 ℃与88.40 min。所以,本研究参考周丽卿等的最佳优化参数对云南卡布里鹰嘴豆进行了三次蛋白质提取的重复实验,同时将冷冻干燥得到的蛋白晶体研磨成粉后，测定了蛋白粉中的粗蛋白含量来验证其纯度,就蛋白质得率与蛋白粉纯度与本研究中的优化方法进行比较,结果如表5所示。

表5 蛋白质得率与蛋白粉纯度比较Table 5 Comparison of yield and purity of protein powder in different optimization parameters

如表5所示,仅从蛋白质得率来看,本法的得率(12.66%±0.14%)要低于参考方法(14.64%±0.30%),差异极显著(p=0.003<0.01)。但是从所得到蛋白粉的纯度来看,经本法所提取的云南卡布里鹰嘴豆蛋白粉纯度(77.82%±0.53%)高于按照参考方法所提的蛋白质纯度(69.86%±1.57%),差异极显著(p=0.007<0.01)。

用本优化条件与周丽卿等人报道的方法[20]相比较,发现两地的鹰嘴豆蛋白质等电点并不相同,这可能是由于选择鹰嘴豆的来源不同,周丽卿等用的是来自新疆的鹰嘴豆,而本研究中的鹰嘴豆来源于云南文山州,两地土壤、光照等生长条件的不同可能导致鹰嘴豆籽粒中蛋白质类型的不同,最终造成两地鹰嘴豆蛋白质等电点的不同。采用本法提取鹰嘴豆蛋白,其得率略低于参考方法,但本方法得到的蛋白质纯度却显著高于参考方法所得的蛋白质纯度。本法与参考方法相比,所用的酸沉pH较高,本法为4.9,参考方法为4.3。在酸沉过程中不可避免地会引入少量淀粉等杂质。不同的酸沉pH使沉淀过程中引入杂质的量不同。而本法所用的最佳碱溶pH较低,只有10,而参考方法中所用的碱溶pH达到了11。过高的pH条件会引起蛋白质的变性。这可能是导致本法蛋白质得率略低但是所提蛋白粉纯度较高的原因。

3 结论

本试验确定了云南文山的卡布里品种鹰嘴豆总蛋白的等电点为4.9,可以为进一步测定云南卡布里品种鹰嘴豆中清蛋白和球蛋白的等电点提供依据。并通过Box-Behnken设计,建立了碱溶酸沉法云南卡布里鹰嘴豆蛋白提取工艺参数的二次多项式数学模型,经检验该模型是合理可靠的,能够比较准确地预测鹰嘴豆蛋白的得率。碱溶酸沉法工艺参数中碱溶pH、碱溶时间对鹰嘴豆蛋白得率有极显著影响(p<0.01),各因素影响主次顺序为碱溶pH>碱溶时间>液料比。完成了对碱溶酸沉法条件的优化,确定了最佳工艺为40 ℃条件下液料比12∶1 mL/g、碱溶pH10、碱溶时间120 min,此时蛋白得率可达12.66%±0.14%，与理论值相差2.39%。

本文所得到的工艺参数具有针对性,既可以充分提取云南卡布里鹰嘴豆中的蛋白质,又可以得到较高纯度的蛋白粉,并用于鹰嘴豆蛋白质的进一步研究,如功能肽的提取等;也可以用于食用蛋白粉的工业化生产,产生经济效益,有助于推广鹰嘴豆在云南地区进一步种植。