C-反应蛋白、血清淀粉酶A蛋白及中性粒细胞表面抗原CD64对新生儿感染性疾病的早期诊断价值

吴玉芹 奎莉越 赵晓芬 李杨方 崔珊 杜琨

新生儿感染性疾病是发生在婴幼儿时期的一类常见疾病，包括肠炎、黄疸、新生儿肺炎、尿布性皮炎等多种感染性疾病［1］。新生儿感染性疾病中，新生儿肺炎、肠炎这类感染性疾病的发生率及致死率均较高，早期诊断并进行相应的干预和治疗能够显著地改善预后，提高患者的生存率［2］。但是新生儿各种感染性疾病早期的临床症状各不相同，多数症状并不典型，常规检测并不能在早期就灵敏的诊断出新生儿感染性疾病，再加上新生儿早期的免疫系统尚未发育成熟，自身对外界环境的抵抗力极差，导致感染疾病后，死亡率很高。因此，早期诊断和及时治疗是决定新生儿感染性疾病预后和生存率的关键，探索早期可靠、灵敏、特异的诊断新生儿感染性疾病的标志物，对于降低新生儿感染性疾病的死亡率至关重要［3］。

C-反应蛋白（C reactive protein，CRP）是目前新生儿感染性疾病中研究的最广泛也是最多的一种急性时相反应蛋白标记物［4］。当机体处于急性状态时如机体受到感染或者组织受到损伤时，CRP的合成会短时间内迅速增加，在36～50 h可达到高峰，含量能够达到正常值的100～1 000倍，因此可以通过检测患者血液中的CRP含量，初步判断患者是否受到感染［5］。血清淀粉酶A蛋白（serum amyloid A，SAA）也是一种在急性时由肝脏分泌的相反应蛋白，属于脂蛋白家族［6］。正常情况下，SAA在健康人血液中含量较低，而新生儿的SAA水平大部分分布在能够检测水平的最低值。有研究表明，在炎症和组织损伤时，SAA明显升高，急性感染病人增高幅度能够较准确的反映病情严重程度，能够作为感染性疾病炎症的标志［6］。中性粒细胞表面抗原CD64（neutrophil CD64，CD64）是一种免疫球蛋白，是IgG的Fc段受体，其相对分子质量为72 000。正常情况下，CD64大部分分布在外周血的巨噬细胞、单核细胞及树突状细胞表面，在中性粒细胞表面水平较低。当受到粒细胞集落刺激因子及细菌细胞壁中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激时，CD64能够迅速在中性粒细胞表面大量表达，同时能够提高氧化代谢和脱颗粒水平，新生儿被细菌感染时CD64含量升高尤为明显［7-8］。因此，本研究拟通过探讨CRP、SAA及CD64在新生儿感染性疾病早期的表达规律，为新生儿感染性疾病的早期诊断和及时治疗提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年5月至2017年5月在昆明市儿童医院新生儿监护病房住院的新生儿疑似感染病例100例，遵循以下入选标准：日龄大于5 d，小于40 d的新生儿，入院时具有如体温升高、腹泻、黄疸、少吃、少哭、呕吐、皮肤黏膜局部感染、泌尿系统感染和感染性休克等疑似感染的临床表现。同时，选取20例相同时期入院，具有相似日龄及胎龄的非感染性疾病（其中新生儿呼吸窘迫综合征5例、母乳性黄疸4例、胃肠功能紊乱7例、头颅血肿4例）新生儿作为对照组。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料

2组患者中感染组100人，其中男性58例，女性42例，对照组20人，其中男性14例，女性6例。感染组和对照组新生儿胎龄分别为（29.3±3.2）周和（30.1±2.4）周，采血日龄为（14.3±1.8）d和（15.4±2.1）d，出生体重为（3.31±0.42）kg和（3.27±0.43）kg。比较2组患者资料，发现2组患者在性别、胎龄、采血日龄和出生体重方面均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。详细记录所有被选入的研究对象入院以后的易感因素、临床症状等，并检测白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞以及CRP5项非特异性指标。

表1 2组新生儿的临床资料比较Table 1 Comparison of clinical data in neonates

1.2.2 标本收集

各组患儿均在治疗前，通过静脉采血2 mL，其中1 mL静置2 h待其凝血后，以3 000 r/min离心10 min，分离得到的血清，于-80℃冰箱保存，待检测CRP及SAA，另1 mL置于含25 U/mL肝素钠的抗凝血管中，用于检测CD64的水平［7］。

1.2.3 CRP的检测

采用双抗体夹心酶联免疫吸附反应试剂盒（英国Abcam公司，货号：ab181416）检测血清CRP含量。操作严格按照试剂盒说明书进行，以≥8 mg/mL为阳性［9］。

1.2.4 SAA测定

采用奥普Qpad金标数码定量分析仪测定SAA的含量，奥普SAA-SPOT试剂盒购自上海奥普生物医药有限公司，操作严格按照操作说明书进行。

1.2.5 CD64测定

流式细胞分析仪检测中性粒细胞表面抗原CD64的含量。取全血50 μL加上20 μL CD64 PE/CD45 Percp抗体（美国BD公司）混匀，暗处放1 h后加FACS溶血剂2 mL，避光放置20 min后用流式细胞仪（美国BD公司FACS Calibur）检测CD64的含量［7］。

1.3 统计方法

采用统计分析软件SPSS 19.0对数据进行统计分析。计数资料以百分比表示，计量资料采用均数±标准差的方式表示；2组间计量资料的分析采用t检验，相关性分析采用Pearson检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 感染组和对照组血清CRP和SAA水平比较

2组患者中，感染组的CRP为（24.48±21.13）mg/L，而对照组的CRP为（5.12±2.21）mg/L，感染组的CRP的水平显著高于对照组的水平。同样，2组患者中，感染组的SAA水平明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）（表2）。

表2 感染组和对照组血清CRP和SAA水平比较Table 2 Comparison of CRP and SAA in the serum between the infected group and the control one

图1 CD64的流式分析直方图Figure 1 Histogram of CD64 by flow cytometry

2.2 感染组和对照组全血CD64水平比较

流式细胞仪CD64检测通过单参数直方图（图1）来分析结果。2组患者中，感染组的全血CD64水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表3。

2.3 ROC曲线图及CRP、SAA和CD64诊断新生儿感染性疾病的敏感性和特异性分析

根据CRP、SAA及CD64的结果绘制ROC曲线（图2）。计算CRP、SAA及CD64的ROC曲线下面积分别为0.600、0.567、0.870，最佳截断值分别为CRP≥8 mg/L、SAA≥6 mg/L、CD64≥2 943个荧光抗体分子/细胞。

表3 感染组和对照组全血CD64水平比较Table 3 Comparison of whole blood CD64 between the infected group and control group

图2 CRP、SAA及CD64的ROC曲线Figure 2 The ROC curves of CRP，SAA and CD64

CRP诊断新生儿感染性疾病的敏感性和特异性分别为58.23%、68.92%；SAA分别为64.21%、64.65%，而CD64分别为92.31%、90.43%，以CD64的敏感性和特异性最强。

3 讨论

新生儿感染性疾病主要包括病毒感染性疾病和细菌感染性疾病，如败血症、手足口病等，这类疾病是造成新生儿死亡的主要原因之一。常规的血液检查如白细胞计数等，目前国内尚无新生儿的血常规参考值，各医院的检查方法缺乏标准化，阳性率不高，且标本容易受到污染，指导临床治疗相对滞后，也不能达到早期诊断的目的。因此，寻找高效、可靠、合理且操作方便的早期新生儿疾病感染标记物，具有极其重要的意义。

本研究所探讨的3种诊断新生儿感染性疾病的标志物在过去的研究中都有过类似的报道。CRP的合成场所主要是肝脏，正常的新生儿出生早期自身免疫功能较低、免疫反应不成熟，导致其炎症反应较弱，因而血液中的含量非常低［4］。但是在过去的研究中，Lannergard等［10］发现，CRP和白细胞等都是非特异性的辅助诊断参考指标，不同个体之间的差异极为显著，而且经常受到感染性疾病以外的影响因素的干扰。因此，运用白细胞和CRP 2个指标作为新生儿感染性疾病的早期诊断均有可能误判。与李松等人［7］研究结果一致，本研究显示，CRP对于新生儿感染性疾病的判断均具有较低的特异性和敏感性，其主要原因可能是因为CRP主要是细菌性炎症的活动指标，而新生儿感染性疾病的种类繁多，成因复杂，并不仅仅主要是由细菌性炎症导致，因此，CRP对于新生儿感染性疾病的早期诊断有一定的参考价值，但并不能成为诊断的金标准。

SAA也是一种在急性时由肝脏分泌的反应蛋白，与CRP一样，在炎症和组织损伤时，会明显升高。但SAA是病毒性炎症的活动指标，CRP在细菌感染性疾病时明显增高，而SAA在细菌感染性疾病时比CRP升高更早，下降更快，幅度更大，在除细菌以外等其他应急状态如病毒感染、呼吸道感染等发生时明显增高［10］。有报道指出，检测SAA/CRP的比值，对SAA与CRP进行联合检测，比单独检测SAA或CRP具有更大的应用价值，联合检测CRP和SAA在血液中的含量可极大地提高早期的诊断效率，SAA/CRP的比值与新生儿感染性疾病存在相关性［11］。因此，SAA为临床诊断的正确性和可靠性又增加了一个新的指标。本研究显示，在临床表现为疑似新生儿感染性疾病时，SAA均明显高于对照组，多种感染性疾病均能出现SAA增高的情况，对于新生儿感染性疾病的早期诊断具有较高的敏感性，但是其特异性不高。与Harr和Ulutas等［12-13］报道一致，SAA在寄生虫感染与外伤等情况下，也会明显增加，这种在多种急性时均出现SAA增高的情况，一方面能使得SAA得到更广泛的应用，另一方面也说明，SAA作为诊断新生儿感染性疾病的标准，特异性并不高。

CD64是一种免疫球蛋白，正常情况下，大部分分布在外周血的巨噬细胞及其他细胞中，中性粒细胞表达较低［15］。有研究报道指出，CD64在非感染性炎症及病毒感染时均不会表达增加，从而说明CD64在早期诊断新生儿细菌性感染时具有较高的特异性［14-15］。本研究显示，与对照组的新生儿相比，疑似感染性疾病的新生儿，其CD64的表达水平显著升高，且不受胎龄影响。CD64的检测还可以使用免疫荧光染色，通过流式细胞分析仪快速检测，不仅操作简单，而且结果重复性好，通常在2 h内就可以完成检测，可为临床早期快速诊断提供重要的信息。与本研究结果一致，汪盈等［15］也在研究中发现，CD64对新生儿感染性疾病的诊断具有较好的敏感性和特异性，而且随着感染程度的不同，CD64的表达水平也有所不同，是早期诊断新生儿败血症的灵敏指标。

综上所述，新生儿感染性疾病中，CRP、SAA、CD64水平的检测都对早期诊断具有一定的帮助。本研究表明，与CRP和SAA相比，CD64具有更高的敏感性和特异性，是新生儿感染性疾病早期诊断的灵敏指标，但目前临床上采用2个或2个以上感染标记物的联合检测来诊断新生儿感染性疾病发生的报道越来越多，对新生儿的早期诊断和治疗具有积极作用。