维甲酸诱导基因I在DSS诱导的慢性肠炎小鼠结肠组织中的表达

吴玉丹，戴发亮，董仕桢，郭腾飞，高 磊，常永超，高 强

1)河南科技大学第一附属医院消化内科；河南科技大学临床医学院 河南洛阳 471023 2)河南科技大学第一附属医院检验科；河南科技大学临床医学院 河南洛阳 471023 3)首都医科大学附属北京康复医院消化内科 北京 100144

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克罗恩病(Crohn′s Disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，是一种肠道慢性非特异性炎症性疾病，其病因和发病机制尚未完全明确，目前认为与遗传易感性、环境、感染、菌群失调、肠黏膜免疫应答失衡及肠上皮功能障碍等因素有关[1]。近年来我国IBD临床诊治数量明显增多[2]。内质网是与蛋白质折叠修饰、转运和分泌功能有关的一种重要细胞器；未折叠或错误折叠蛋白在内质网大量蓄积可以导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。肠上皮细胞ERS导致的肠黏膜屏障损伤是IBD的重要原因[3]。机体可通过启动一系列适应性反应即“未折叠蛋白反应”(unfolded protein response，UPR)[4]来减轻ERS对细胞的损害，维持内环境稳态。ERS主要通过3种内质网跨膜感受器触发UPR，肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1) 是UPR的一个重要传感器，消化道表面表达有IRE1亚型(IRE1α和IRE1β)，磷酸化IRE1α(p-IRE1α)是其活化形式。在长期ERS状态下，IRE1α可以促进基因编码的内质网靶向蛋白质的降解，降低ERS的蛋白负荷，这个过程被称为依赖IRE1调节的衰减作用(regulated IRE1-dependent decay，RIDD)[5-6]。维甲酸诱导基因I (retinoic acid induced gene-I，RIG-I)参与IRE1-RIDD-RIG-I通路，这个通路与黏膜固有免疫和炎症反应有关[7-9]。RIG-I是DexD/H盒的RNA解旋酶家族的成员，在细胞内作为受体识别病毒双链RNA。最近研究[10]表明，RIG-I不仅具有抗病毒功能，还参与炎症反应、肿瘤细胞增殖或凋亡、吞噬、免疫调节等诸多生物学事件。有关IRE1-RIDD-RIG-I通路在IBD的发病机制尚不明确。该研究通过分析IRE1和RIG-I在葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS)诱导的小鼠慢性结肠炎模型的表达情况来探讨IRE1-RIDD-RIG-I通路在IBD发病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物8～10周龄健康清洁级C57BL/6(B6)雌性小鼠购自北京维通利华公司，体重为20～23 g，用混合配方颗粒饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司)饲养于河南科技大学第一附属医院新区医院动物实验中心，正常饮用无菌蒸馏水。

1.2主要试剂与仪器DSS(美国MP Biomedicals公司)；戊巴比妥钠(德国Merck公司)；Trizol法总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)；免疫组化检测和蛋白印迹Western blot检测用RIG-I一抗(英国Abcam公司)，p-IRE1一抗(美国Thermo公司)；免疫组化检测SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；DAB显色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；RIPA裂解液试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；BCA试剂盒(美国Pierce公司)；ECL试剂盒(美国Santa Cruz公司)；RT-PCR仪(美国Bio-Rad公司)；光学拍照显微镜系统(日本Olympus公司)。

1.3实验动物的分组、造模及取材处理造模前，小鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法将小鼠分为2组，每组8只。对照组：饮用无菌蒸馏水；慢性炎症组：先自由饮用10 g/L DSS溶液(现配现用)7 d，然后饮用无菌蒸馏水14 d，3周为一个周期(共3个周期)建立小鼠慢性结肠炎模型。于造模第10周末腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后颈椎脱臼法处死小鼠，剖腹取全结肠，测量长度。记录结肠内是否有血性内容物，PBS漂洗并翻转结肠，从远端起取第一段约0.5 cm放于包埋框，浸泡于体积分数10%甲醛中固定，石蜡包埋， 4 μm厚切片以备HE和免疫组化染色用；取第二段约1.0 cm结肠置于含RNA later液的离心管，先在4 ℃冰箱放置24 h后，转入-80 ℃冰箱，用于相关mRNA的检测；再取第三段约1.0 cm放入1.5 mL离心管，液氮冻存后转入-80 ℃冰箱，用于Western blot。

1.4两组小鼠结肠组织学表现、疾病活动指数(DAI)评分、结肠长度变化及肠道炎症程度评分实验期间每3 d于早晨9:00测量各组小鼠体重1次，观察小鼠活动、摄食和饮水情况，记录大便性状、是否便血及便血程度。HE染色观察结肠组织学变化：在高倍镜(×400)下，每张切片选择10个视野共计数1 000个细胞。参照Jackson等[11]的方法进行DAI评分，DAI取体重下降百分比、大便性状、便血评分三者均值(取材时测量结肠长度，依据张静等[12]的方法进行便血评分)。肠道炎症程度评分参照Esworthy等[13]的方法。

1.5两组小鼠结肠组织中IL-6、IL-8、TNF-α、IRE1α及RIG-ImRNA表达水平的检测采用Trizol法提取小鼠结肠组织总RNA，测定RNA纯度和浓度后取RNA 2 μg，逆转录合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存。冰上配制PCR反应体系(共25 μL)：SYBR Premix EX TaqⅡ(×2)12.5 μL，上下游引物各1 μL(浓度10 μmol/L)，RNase-Free水8.5 μL，cDNA 2 μL。每个样本设3个复孔。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性 5 s；根据引物Tm值设置退火温度，退火时长30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算各指标mRNA相对表达量。引物由上海生工生物工程公司设计并合成(表1)。

表1 引物名称及序列

1.6两组小鼠结肠组织中p-IRE1α、RIG-I蛋白表达的免疫组化检测按照免疫组化检测试剂盒说明书进行操作。p-IRE1α一抗按1∶500稀释，RIG-I一抗按1∶600稀释，生物素化山羊抗兔IgG作为二抗。用PBS缓冲液代替一抗和二抗作阴性对照。DAB显色，苏木精复染；干燥封片后在高倍镜(×400)下，参考文献[14-15]报道的方法观察p-IRE1α、RIG-I蛋白的表达情况。

1.7两组小鼠结肠组织中p-IRE1α、RIG-I蛋白表达的定量分析取40～60 mg小鼠结肠组织置于匀浆器中，加入1 mL RIPA裂解液，充分匀浆后离心取

上清。BCA法测定蛋白浓度。将蛋白稀释成适当浓度，100 ℃变性5 min，加20 μg样品进行SDS-PAGE，之后将蛋白转移到PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉溶液封闭，分别滴加p-IRE1α和RIG-I抗体一抗(按1∶500稀释)、二抗(按1∶2 000稀释)，ECL显色1或3 min，成像系统成像后用Image J软件进行灰度值分析。

1.8统计学处理采用SPSS 20.0进行分析，应用两独立样本的t检验比较两组小鼠DAI、结肠长度、肠道炎症程度评分以及结肠组织中炎性因子、IRE1α、RIG-I mRNA及蛋白表达的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1两组小鼠一般活动情况观察对照组小鼠每天饮水摄食正常，反应机警，大小便正常，体重增加。慢性炎症组造模开始后小鼠即出现精神萎靡，体重减轻；第7天小鼠均出现稀血便。在第一个周期结束时，慢性炎性组平均体重下降最多；造模结束时，两组小鼠均无死亡；部分小鼠大便潜血实验阳性，无明显肉眼血便。

2.2两组小鼠结肠组织学表现情况、DAI评分、结肠长度变化及肠道炎症程度评分比较见图1、表2。对照组小鼠组织病理学显示结肠黏膜腺体结构完整，未见炎症细胞浸润；慢性炎症组结肠黏膜结构不规则，腺体萎缩，细胞结构紊乱，隐窝异常，杯状细胞消失，局部炎症细胞浸润，并可见隐窝呈慢性炎症改变伴不规则增生。造模结束后，慢性炎症组DAI评分、肠道炎症程度评分均高于对照组，结肠长度短于对照组。

A：对照组；B：慢性炎症组图1 两组小鼠结肠组织学表现(HE，×200)表2 两组小鼠DAI评分、结肠长度及肠道炎症程度评分比较(n=8)

组别造模结束时DAI评分/分结肠长度/cm肠道炎症程度评分/分对照组0.03±0.016.8±0.30.02±0.01慢性炎症组3.50±0.705.7±0.29.20±0.40t8.7038.0708.852P<0.001<0.001<0.001

2.3两组小鼠结肠组织中炎性因子、IRE1α、RIG-ImRNA及蛋白的表达比较见表3、图2和3。由图3可知，p-IRE1α主要在结肠上皮细胞刷状缘、浆细胞等细胞胞质中表达；RIG-I蛋白主要表达于结肠上皮细胞的胞质、间质细胞的胞质中。

表3 两组小鼠结肠组织中炎性因子、IRE1α、RIG-I mRNA及蛋白的表达比较(n=8)

A：RIG-I蛋白； B：IRE1α蛋白；1：对照组；2：慢性炎症组图2 两组小鼠结肠上皮组织中RIG-I和IRE1α蛋白免疫组化结果(DAB，×400)

图3 两组小鼠结肠上皮组织中RIG-I和p-IRE1α蛋白的Western blot结果

3 讨论

本实验用DSS诱导B6小鼠，经过3个周期共10周的造模诱导小鼠慢性结肠炎来模拟人UC的发生发展过程。造模过程中，肠炎小鼠与人类UC有相似症状，如体重减轻、腹泻、血便等；慢性炎症组小鼠结肠缩短，且缩短程度与炎症程度一致，病理表现为黏膜结构不规则，隐窝结构紊乱，腺体变形萎缩，黏膜及黏膜下层大量炎症细胞浸润等，同时伴有DAI增高；TNF-α、IL-8、IL-6 mRNA升高。

实验结果显示慢性炎症组IRE1α mRNA、RIG-I mRNA、p-IRE1α和RIG-I蛋白的表达量低于对照组，表明IRE1-RIDD-RIG-I通路在炎症时被抑制。IRE1-RIDD-RIG-I通路在黏膜表面的固有免疫应答将针对某些微生物的先天性免疫应答信号与内质网相关联，影响内质网功能[9]。IRE1不仅可以作为防御受体也可作为模式识别受体，感知外源入侵的病原微生物和内源性的未折叠或错误折叠的蛋白质，并根据不同的应激状态调节内质网功能。在应激状态下，活化的p-IRE1 激活细胞内激酶和核酸内切酶结构域移码剪切XBP1的mRNA(XBP1u)成为具有活性的XBP1s而进入细胞核调节基因转录，同时把其他mRNA剪切为未标记的片段呈递给配体感受器RIG-I，激活的RIG-I通过下游接头蛋白MAVS(也称IPS-1、CARDIF或VISA)诱导Ⅰ型干扰素IFN的产生、NF-κB调控免疫反应和炎症反应[8]。长期ERS状态下，RIDD过程可以通过降解内质网结构蛋白和下调Caspase 2触发细胞凋亡。活化的多聚化IRE1还可以通过TRAF2激活ASK1-JNK/IKK通路调节炎症反应。据Coelho等[5]报道，IRE1除了XBP1还有更广泛的mRNA作用底物范围，随后这也在裂殖酵母和哺乳动物细胞中得到证实。Maurel等[16]提出XBP1剪切与RIDD是 IRE1核糖核酸酶活化调控的两种不同细胞反应，两者在内质网应激时会导致细胞不同的命运。

本实验结果显示p-IRE1α、RIG-I的表达下降导致内质网调节未折叠或错误折叠的蛋白质能力减弱，可能参与了IBD的发生和发展。新近的研究[10]显示RIG-I在人和小鼠结肠炎相关性结肠癌组织中表达也下调，且RIG-I缺乏的小鼠与野生型小鼠相比肠道菌群紊乱，IgA、 Reg3γ和 Pdcd1表达水平降低，因此，IRE1-RIDD-RIG-I通路的激活可能影响肠道菌群，并且导致潘氏(Paneth)细胞和杯状细胞分泌功能(如分泌抗菌肽和黏蛋白等)异常，使正常肠道抗菌作用和黏蛋白屏障受损进而引起持续的炎症刺激，影响IBD的发生和发展。此外，IRE1-RIDD-RIG-I通路的下调可能使内质网的自噬功能减弱，从而降低内质网降解异常蛋白质的能力，这也与以往报道[17-18]的未折叠蛋白反应与自噬和固有免疫密切相关，自噬功能受损会促进IBD的发生和发展一致。

综上所述，本实验证实在肠道慢性炎症的发生和发展过程中IRE1-RIDD-RIG-I通路被抑制，这种抑制可能促进了炎症的发生和发展，其具体调控机制还有待进一步研究，以期为IBD的治疗提供新靶点。

致谢：感谢轩青霞、冯丹丹、陈攀、邢莹莹和张腊梅在实验中给予的大力帮助。