鹅褪黑素受体Mel1c基因的组织表达特征

王淑娟，刘文举，闻爱友，庞训胜

(安徽科技学院 动物科学学院，安徽 凤阳 233100)

褪黑素是由松果体和一些其他器官组织合成的一种吲哚类激素，其不仅普遍存在于脊椎动物中，在植物和低等动物中也可合成[1]。褪黑素合成分泌与光照周期同步，可调节动物的昼夜节律和季节节律、体温、神经内分泌、生殖等生理功能[2-5]。褪黑素具有脂溶性和水溶性、低血浆蛋白结合力的特征，其吲哚环可与一些羟基自由基(—OH)、烷过氧化基(ROO—)等结合发生化学反应，故可直接清理机体内的自由基、氧化物等，是一种高效的自由基清理剂[6]。但其对机体其他生理功能的调节作用需要在褪黑素受体的介导下完成，所以褪黑素受体的分布对褪黑素发挥生理功能具有重要意义。

目前，在脊椎动物哺乳动物中成功克隆了2种褪黑素受体亚型：MT1和MT2，而在脊椎动物非哺乳动物中成功克隆了3种褪黑素受体基因：Mel1a、Mel1b和Mel1c，其中Mel1a和Mel1b序列与哺乳动物的MT1和MT2具有较高的同源性，而Mel1c是仅存于非哺乳动物中的褪黑素受体。这些受体都属于G蛋白偶联受体，主要在脑组织中表达，另外在一些动物的周边组织中也存在表达分布，如生殖腺、胃肠系统、肾脏、卵巢、精子和颗粒细胞等[7-12]。有研究表明，在鹌鹑、鱼、鸡、非洲爪蟾、斑马鱼中均存在这3种受体[13-17]。在鹌鹑的新鲜蛋胚盘中存在3种受体亚型，而在排出的卵母细胞中仅存在Mel1c，这一研究填补了对Mel1c研究的又一空白[13]。在河豚中研究发现，Mel1cmRNA在脑和视网膜中表达，而在肝脏、脾脏、小肠、心脏和肾中几乎不表达[14]。可见，不同物种中Mel1c基因的表达分布存在一定差异。目前对鹅的褪黑素受体研究还比较少见，本人在先前的研究中发现，鹅大脑组织中存在3种褪黑素受体，但其在机体中的分布尚不清楚，对禽类特有受体Mel1c基因的组织表达分布的研究，可为进一步探究褪黑素对鹅生理功能的调节作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验对象及主要试剂

产蛋期母鹅6只，购自蚌埠市种鹅场，颈静脉放血屠宰，30 min内取心脏、肝脏、肾脏、肺脏、胰脏、脾脏、卵巢、大脑、胸肌及F1、F2、F3、F4、F5卵泡组织于液氮中保存备用。

主要用试剂包括总RNA提取试剂盒、dNTP Mix、TaqDNA聚合酶等(北京天根，中国)、反转录试剂盒(Fermentas，美国)、LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master Mix(罗氏，德国)。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取与反转录

将所取的鹅各组织分别取出约50 mg，在盛有液氮的研钵中研磨成粉末状，然后将其移入裂解液中，采用动物组织总RNA提取试剂盒提取总RNA，用分光光度计测定其浓度，-80 ℃保存备用。

将所提取的各组织的总RNA(浓度调整一致)用反转录试剂盒反转录成cDNA，RT-PCR程序及条件：5.0 μL RNA、0.5 μL Oligo(dT)引物和6.5 μL RNase-free H2O，混匀后65 ℃ 5 min，然后迅速置于冰上预冷2 min；再向混合液中加入5.0 μL M-MLV RT 5×Buffer、1.5 μL dNTP、0.5 μL RNase Inhibitor和1 μL反转录酶，混匀后42 ℃ 60 min，72 ℃ 10 min，所得产物即为cDNA，保存于-20 ℃备用。

1.2.2 PCR引物设计

参照GenBank中原鸡(NM_205361)、斑马鱼(NM_001161484)、狼鲈(EU378920)等Mel1c基因序列，利用Primer 5.0软件优化设计1对引物，内参基因GAPDH参考Duckett等设计的引物序列[18]，送上海生工合成，见表1。

1.2.3 PCR扩增及鉴定

以反转录所得cDNA为模板，利用表1中的引物进行Mel1c基因扩增，PCR反应体系：1.0 μL cDNA，各0.5 μL 10 mmol·L-1正反向引物，0.5 μL 10 mmol·L-1dNTP，2.5 μL 10×Buffer， 0.5 μL 5 U·μL-1Taq酶，加ddH2O补至25.0 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，在成像系统中观察目的片段。用凝胶试剂盒回收目的片段DNA，然后送上海生工测序。

1.2.4 Mel1c mRNA在各组织中的表达分布

表1实验引物

Table1Primers used in present study

基因Gene序列Sequence产物大小Productsize/bp退火温度Annealingtemperature/℃Mel1cCAGATAAGTGGGTTCCTGATGGG10364ACCGAAGGCTGTGGCAGATGTAGGAPDHGTGGTGCAAGAGGCATTGCTGAC8660GCTGATGCTCCCATGTTCGTGAT

经1.2.3节所扩增的产物测序正确后，以表1中Mel1c和GAPDH引物进行qRT-PCR扩增，反应体系包括5.0 μL LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master Mix、1.0 μL cDNA模板、0.5 μL 10 mmol·L-1各引物，补充ddH2O至10.0 μL体系，然后进行qRT-PCR程序(表2)。每个样本重复3次。将产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测各组织中Mel1cmRNA相对表达量。

1.3 数据分析

利用LightCycler 480系统软件分析qRT-PCR数据，目的基因相对表达水平采用2-ΔΔCt方法计算。利用SPASS 11.0计算重复样本间Ct均值及标准差，使用Excel绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 鹅各组织总RNA

提取的总RNA采用琼脂糖凝胶电泳抽样检测，图1显示的2条亮带分别为28S和18S，表示提取RNA质量较好，无RNA降解现象，浓度测定结果均在1 000 ng·mL-1以上，可进行反转录实验。

2.2 鹅Mel1c基因扩增

鹅Mel1c基因的PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小与预期值相当(图2)。测序结果表明，所扩增的Mel1c基因片段序列与GenBank中鹅的Mel1c序列相同。

2.3 Mel1c mRNA在鹅各组织中的表达分布

以鹅的心脏、肝脏、肾脏、肺脏、胰脏、脾脏、卵巢、大脑、胸肌和各等级卵泡cDNA为模板，对Mel1c基因和GAPDH内参基因进行PCR扩增，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，Mel1cmRNA在鹅的上述组织中均有表达，各组织中的表达量存在一定的差异性，其中胰脏、脾脏、肾脏、卵巢中表达量较高，肺脏次之，心脏、胸肌、大脑水平相当，肝脏中最少(图3)。而在卵泡组织中，F4级卵泡中最高，其次为F5级卵泡，F1级卵泡中表达量最少(图4)。

利用qRT-PCR进一步定量测定鹅各组织中Mel1cmRNA的相对表达量，以大脑中表达量为对照，结果表明，胰脏、脾脏、肾脏、卵巢中的表达量明显高于大脑内，肺脏中的表达量亦高于大脑(图5)，各级卵泡中的表达量均明显高于大脑中的表达量，且以F4和F5中的表达量最高(图6)。这一结果与琼脂糖凝胶电泳结果相似。

表2qRT-PCR反应程序

Table2Reaction program of qRT-PCR

反应步骤Reaction stepT/℃t/s循环次数Cycle times荧光信号Fluorescence signal预加热Preheating95301无None955扩增Amplification642045在延伸阶段结束时At the end of the extension phase7220熔解曲线Melting curve60251在温度缓慢升高过程中In the process of slow rise in temperature冷却Cooling40101无None

1， 大脑；2，胸肌；3，肝脏；4，卵巢；5，肺脏；6，胰腺。1， Brain; 2， Breast muscle; 3， Liver; 4， Ovary; 5， Lung; 6， Pancreas.图1 鹅各组织总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from goose tissues

M，Marker；1、2、3，PCR产物。M， Marker; 1， 2， 3， PCR product.图2 鹅Mel1c基因PCR转录产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Mel1c in goose detected by PCR

图3 Mel1c mRNA在鹅各组织中的表达分布Fig.3 Expression of Mel1c mRNA in various tissues of goose

图4 Mel1c mRNA在鹅各级卵泡中的表达分布Fig.4 Expression of Mel1c mRNA in follicles of goose

图5 Mel1c mRNA在鹅各组织中的差异性表达Fig.5 Differential expression of Mel1c mRNA in various tissues of goose

图6 Mel1c mRNA在鹅各级卵泡中的差异性表达Fig.6 Differential expression of Mel1c mRNA in follicles of goose

3 讨论

目前，我国是鹅饲养量最多的国家，品种资源丰富，但大多属于肉用品种，繁殖率较低，因而如何提高鹅的繁殖性能成为研究热点之一。有研究表明，褪黑素可通过下丘脑-垂体-性腺轴作用，调节动物繁殖性能；也可直接作用于卵巢，调节卵泡发育。基于此，本研究旨在探究介导褪黑素作用的褪黑素受体Mel1c基因在鹅各组织中的表达分布，为进一步探究褪黑素对鹅生理功能，特别是繁殖性能的调节作用奠定了良好的基础。

目前，研究较多的是MT1(Mel1a)和MT2(Mel1b)，而对Mel1c的研究较少。MT1和MT2分布于所有脊椎动物的神经系统和周边组织[19-20]，其广泛存在于大脑、下丘脑、中脑，嗅球、视交叉等脑区，在脊髓和视网膜上也存在，近来在心、肝、脾、肺、肾、胃肠、胸腺、淋巴结、肾上腺、性腺等均有发现。本课题组在牛及鸭中也检测了褪黑素受体的表达分布，结果表明，Mel1a和Mel1b广泛分布于大脑、胸肌、心、肝、脾、肺、肾、胰、卵巢等组织中[21-22]，MT1和MT2均在牛卵巢颗粒细胞中存在表达[12]。Mel1c在非哺乳动物的脑和视网膜中均存在[14，23]。MT1和Mel1c有很多相似性，如Mel1c对光的反应和MT1的一样，即随着昼夜节律的变化，受体mRNA随之变化，高峰出现在夜晚。Park等[14]克隆河豚脑和视网膜组织中的Mel1c受体基因表明，Mel1cmRNA在神经组织(视网膜和脑)中有表达，而在周边组织(肝脏、脾脏、小肠、心脏和肾)几乎没有表达，并且其子夜时在脑和视网膜中的表达量明显高于中午。本研究利用qRT-PCR技术探究了Mel1cmRNA在鹅不同组织中的表达及相对表达量，结果表明，在大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、胸肌、卵巢、胰脏、脾脏及F1-F5各级卵泡中均存在Mel1cmRNA的表达，且以卵巢、脾脏、肾脏和胰脏中表达量较高，而在各级卵泡中，Mel1cmRNA的表达量随着卵泡发育而逐渐增多。

我们的研究进一步证实了褪黑素可通过各组织器官中褪黑素受体发挥广泛的生物学作用，特别是对生殖机能的调控作用。在鹌鹑中，3种褪黑素受体表达存在差异性，卵泡发育过程中，卵母细胞中存在3种受体亚型，而排卵后的卵母细胞中仅存在Mel1c，但在早期胚胎中又存在3种受体[13]。对鸡的研究表明，3种褪黑素受体也广泛地分布于生殖组织中，而且在排卵前和排卵后的卵泡颗粒层和卵泡膜层存在一定差异性，在白色的小卵泡中，只有Mel1b受体，无Mel1a和Mel1c表达。黄色卵泡中，3种受体均存在。Mel1a表达仅存在于卵泡膜层，卵泡颗粒层中无表达；而Mel1b和Mel1c在颗粒层和膜层均有表达。对于退化的卵泡中，Mel1a和Mel1c受体表达量显著升高，退化后期表达量降低[15]。结合这些结果和我们研究结果可进一步推断，褪黑素受体分布对卵巢组织中的细胞功能有一定的调节作用，特别是卵泡发育。