虾源蜡样芽孢杆菌D7的生态安全性评价

张洪玉，王海波，2，杨移斌，赵明军，夏 磊，2，*

(1.中国水产科学研究院 无公害渔药创制中心，北京100141；2.北京鑫洋水产高新技术有限公司，北京102488；3.中国水产科学研究院 长江水产研究所，湖北 武汉 430233；4.中国水产科学研究院 渔业发展战略研究中心，北京 100141)

益生菌由于其独特的功能，在养殖过程中备受青睐。随着益生菌研究的不断深入，水产用益生菌使用的安全性受到越来越多的关注[1-6]。由于水产用益生菌的种类、使用方法及来源较其他产业存在较大差异，对水产用益生菌进行安全评价时，不仅要考虑其动物的毒性作用，还应该考查其对水体生态环境的影响。

蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)主要功能是调节肠道菌群和治疗腹泻，其作为生物制品已经被批准用于人体及畜禽养殖[7-8]。Navinchandran等[9]研究表明，蜡样芽孢杆菌可提高斑节对虾的免疫力和抗病力，促进其生长。水体中添加105～106cfu·mL-1蜡样芽孢杆菌PC465，可以提高凡纳滨对虾抗白斑综合征感染能力[10]。饲料中添加蜡样芽孢杆菌及其生物膜，可改变对虾肠道的微生物组成，提高凡纳滨对虾生长速度、提高抗病能力[11]。本研究团队从凡纳滨对虾肠道中分离到蜡样芽孢杆菌D7，拌饵投喂，可显著促进凡纳滨对虾生长，提高其机体免疫力和抗氨氮的作用[12-13]。

本研究对蜡样芽胞杆菌D7进行了生态安全性评价，分别研究了蜡样芽孢杆菌对水质3项指标、浮游藻类、水生动物等水生态系统的影响，为该菌株产业化提供支撑，也对水产益生菌生态安全性评价方法进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蜡样芽孢杆菌菌种由本课题组从凡纳滨对虾肠道中分离鉴定[14-15]，并在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号CGMCC No.9139。进行各试验前，将菌株送到北京睿博兴科生物技术有限公司进行16S rDNA测序，经测序结果进行BLAST分析，与蜡样芽孢杆菌一致性为100%。

普通小球藻(Chlorellavulgaris)购自中国科学院淡水藻种库，藻类培养基为BG11，由藻种库提供。大型蚤(Daphniamagna)、斑马鱼(Danioretio)购自北京潘家园观赏鱼市场，草鱼(Ctenopharyngodonidella)购自北京市龙池养殖场，选择规格相近[体质量(30.3±4.8 g)]、健康活泼的进行试验。凡纳滨对虾购自河北黄骅中捷农场个体养殖场，选择规格相近 [体长(5.2±0.7) cm]、活力好的进行试验，淡化盐度到0.3%。

1.2 试验方法

1.2.1 蜡样芽孢杆菌对氨氮、亚硝酸盐及磷酸盐的影响

试验方法参考文献[16-17]并进行改进，具体如下：取室外斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)养殖废水，加入适量的NH4Cl、NaNO2及KH2PO4，使水体中初始氨氮、亚硝态氮、磷酸盐浓度分别为2、2、0.6 mg·L-1。各试验分别设置6个试验组，每组3个重复。在氨氮、亚硝酸盐及磷酸盐初始浓度下分别接种蜡样芽孢杆菌，使菌体终浓度达到0、104、105、106、107、108cfu·mL-1。分别于0、2、4、8、14 d取样测定。氨氮采用纳氏试剂分光光度法测定，亚硝态氮采用分光光度法，总磷采用钼酸铵分光光度法测定。

1.2.2 蜡样芽孢杆菌对小球藻生长的影响

试验方法参考文献[18-20]并进行改进，具体如下：设置6个试验组，每组3个重复。将蜡样芽孢杆菌加入适量无菌蒸馏水中于32 ℃水浴重悬，无菌操作加入到100 mL BG11藻类培养基中，使菌终浓度达到0、104、105、106、107、108cfu·mL-1，分别加入初始细胞浓度为105mL-1的小球藻藻液 10 mL。混合液在(25±1)℃、连续均匀光照(8 000 lx)、定期人工摇动等条件下连续培养72 h，每24 h取样1次，紫外分光光度计测定光密度值。根据Arnon公式[21]计算叶绿素a含量。以叶绿素a为纵坐标轴、以时间为横坐标绘制小球藻的生长曲线，观察蜡样芽孢杆菌对小球藻生长的影响。

1.2.3 蜡样芽孢杆菌对大型蚤急性毒性试验

试验方法参考文献[22]。试验在光照培养箱中进行，温度为(25±1)℃，光照强度为3 000 lx，每天光照10 h。设置6个试验组，每个处理3个重复，各处理组蜡样芽孢杆菌终浓度分别为0、104、105、106、107、108cfu·mL-1。将不同浓度蜡样芽孢杆菌溶液置于100 mL烧杯中，每个烧杯放置大型蚤20个，分别于1、2、4、8、16、24、48、96 h定期进行观察，记录大型蚤行为特征。

1.2.4 蜡样芽孢杆菌对斑马鱼、草鱼、对虾的急性毒性测定

3种养殖动物急性毒性试验均在中国水产科学研究院无公害渔药创制中心循环水系统进行。试验方法参考文献[23]。试验期水温控制在24～26 ℃，pH 7.2～7.5。

斑马鱼急性毒性试验：设置6个试验组，每组3个重复，每个重复30尾，养殖水体100 L。将蜡样芽孢杆菌加到试验缸，使菌终浓度分别为0、104、105、106、107、108cfu·mL-1，分别于1、2、4、8、16、24、48、96 h观察鱼体反应能力，游动能力、呼吸能力等指标，统计死亡情况。

凡纳滨对虾急性毒性试验：设置6个试验组，每组3个重复，每个重复30尾，养殖水体200 L，水体盐度调到0.3‰。将蜡样芽孢杆菌分别加到试验缸，使菌终浓度分别为0、104、105、106、107、108cfu·mL-1，分别于1、2、4、8、16、24、48、96 h观察对虾的应激能力，游动能力等指标，统计死亡情况。

草鱼急性毒性试验：设置6个试验组，每组3个重复，每个重复30尾，养殖水体200 L。分别口服灌胃浓度为0、108、109、1010、1011、1012cfu·kg-1蜡样芽孢杆菌。按照灌胃量，将菌泥全部重悬到0.4 mL超纯水中，并加入少量食用色素以便观察回吐情况。通过灌胃针灌胃，对照组灌胃等体积的含有食用色素的超纯水，灌胃前禁食24 h，灌胃后48 h投喂经过灭菌的商品饲料。

1.3 数据处理与统计分析

试验数据应用SPSS 16.0进行单因素方差分析和LSD多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度蜡样芽孢杆菌对氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐的影响

不同浓度蜡样芽孢杆菌对氨氮的影响见图1。研究发现，较高浓度下(107、108cfu·mL-1)，第2、4、8、14天蜡样芽孢杆菌显著降低水体中氨氮浓度(P<0.05)；较低浓度下(104、105cfu·mL-1)，除第4天与对照组差异显著(P<0.05)外，其余时间点水体中氨氮浓度均无显著差异。蜡样芽孢杆菌浓度为106cfu·mL-1时，在第2、4天水体中氨氮浓度与对照组差异显著(P<0.05)，其余时间点差异不显著。

柱上无相同小写字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。C0～C5水体中蜡样芽孢杆菌浓度分别为0、104、105、106、107、108 cfu·mL-1。下同。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. C0～C5 represented groups of different Bacillus cereus concentration among 0、104、105、106、107、108 cfu·mL-1. The same as below.图1 不同浓度蜡样芽孢杆菌对氨氮含量的影响Fig.1 Effects of different concentration of Bacillus cereus on ammonia nitrogen

不同浓度蜡样芽孢杆菌对亚硝酸盐的影响见图2。较高浓度下(107、108cfu·mL-1)，第2、4、8、14天水体中亚硝酸盐浓度较对照组显著降低(P<0.05)；较低浓度下(104cfu·mL-1)，第8天水体中亚硝酸盐浓度较对照组显著降低(P<0.05)；蜡样芽孢杆菌浓度为105、106cfu·mL-1时，在第4、8天水体中亚硝酸盐浓度较对照组显著降低(P<0.05)，其余时间点差异不显著。

不同浓度蜡样芽孢杆菌对磷酸盐的影响见图3。蜡样芽孢杆菌浓度为105、106、108cfu·mL-1处理2 h后，水体中磷酸盐浓度较对照组显著下降(P<0.05)，其余时间点均未表现出显著性差异(P>0.05)。

2.2 不同浓度蜡样芽孢杆菌对小球藻的影响

在小球藻培养液中添加不同浓度蜡样芽孢杆菌后，在各时间点产生不同的影响(图4)。24 h时，106、107、108cfu·mL-13个较高浓度处理组较对照组差异显著(P<0.05)，104、105cfu·mL-12个浓度处理组较对照组差异不显著；48 h时，106、107、108cfu·mL-13个浓度处理组较对照组差异极显著(P<0.01)，104、105cfu·mL-12个浓度处理组较对照组差异不显著；72 h时，104、105cfu·mL-12个浓度处理组较对照组差异显著(P<0.05)，106、107、108cfu·mL-13个浓度处理组较对照组差异极显著(P<0.01)。从整体趋势来看，蜡样芽孢杆菌在104～108cfu·mL-1浓度范围内能够促进小球藻的繁殖，并与菌浓度呈现正相关关系。

图2 不同浓度蜡样芽孢杆菌对亚硝酸盐含量的影响Fig.2 Effects of different concentration of Bacillus cereus on nitrite

图3 不同浓度蜡样芽孢杆菌对磷酸盐含量的影响Fig.3 Effects of different concentration of Bacillus cereus on phosphate

图4 蜡样芽孢杆菌对小球藻叶绿素a含量的影响Fig.4 Effect of different concentrations of Bacillus cereus on chlorophyll-a of Chlorella vulgaris

2.3 不同浓度蜡样芽孢杆菌对大型蚤、斑马鱼、草鱼、对虾的急性毒性作用

水体中蜡样芽孢杆菌浓度为104、105、106、107、108cfu·mL-1时，大型蚤、斑马鱼、对虾均未出现死亡，活动能力正常。蜡样芽孢杆菌灌胃剂量为108、109、1010、1011、1012cfu·kg-1时，各时间点处理组均未发现死亡。

3 讨论

水产微生态制剂同其他产业微生态制剂在使用方式上有一定的差异。水产用微生态制剂既有泼洒到水体中用于水体环境改良，又可添加到饲料中。泼洒用微生态制剂使用量远远大于拌饵投喂量。

养殖水域生态系统由非生物环境和生物群落组成。非生物环境中营养盐类是养殖过程中重点关注的指标，氨氮及亚硝酸盐含量过高，会对水产养殖动物产生一定的毒性。高密度、高投饵的养殖池塘中，无机磷含量普遍偏高[24]。本研究以氨氮、亚硝酸盐及磷酸盐为营养盐指标评价了蜡样芽孢杆菌对3项指标的影响，结果表明，高浓度能够显著降低氨氮及亚硝酸盐，低浓度对氨氮及亚硝酸盐没有持续显著的影响，这同王春迪等[10]的结果相近。

小球藻作为绿藻门的代表藻种之一，由于易于培养、计数等优点，成为学者们藻类生态评价中最常用的一种[25]。宋增福等[5]利用小球藻评价地衣芽孢杆菌T-1对藻类生长的影响，对小球藻没有毒性作用。曹海鹏等[6]研究结果表明，在0～2 000 mg·L-1浓度范围内，解淀粉芽孢杆菌均能促进小球藻的繁殖。本研究中，蜡样芽孢杆菌在104～108cfu·mL-1范围内，均不同程度促进小球藻的繁殖，这与以上两位学者研究结果相似。王善龙等[26]分离的蜡样芽孢杆菌菌株可有效抑制绿色颤藻的生长，为波吉卵囊藻等绿藻占据生态优势提供了有利空间。

大型蚤具有繁殖快、敏感性高等特点，广泛用于药物筛选及生态环境评价[27]。斑马鱼作为模式动物，有关其生态毒性及药物评价有诸多报道[28]。研究结果表明，蜡样芽孢杆菌浓度在108cfu·mL-1以下时，蜡样芽孢杆菌对大型蚤和斑马鱼均未产生毒害。蜡样芽孢杆菌浓度在108cfu·mL-1以下时，未对对虾产生毒害。草鱼灌喂蜡样芽孢杆菌1012cfu·kg-1，未产生毒害作用。

随着国家对抗生素使用的限制，微生态制剂作为绿色投入品被水产业视为未来发展方向。学者们往往关注菌种的筛选和菌株的功能作用，对水产微生态制剂尤其是泼洒使用造成的生态安全关注较少。本研究选择蜡样芽孢杆菌进行生态学评价，不仅仅是为了探讨其产业化的可行性，还因为该菌在医药、畜禽上的广泛应用，且有携带毒力的风险，故对其生态安全性进行评价更具有典型性。