谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞凋亡及Bcl-2、HSP70表达的影响

张响英，唐现文

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300； 2.南京农业大学，江苏 南京 210095)

应激反应是机体对外界环境中不利因素所做出的一种保护性应答。生物体在应激条件下(如高温、炎症、过氧化物、肿瘤坏死因子等)都会产生一系列普遍而保守的应答，激活细胞信号通路，诱导细胞基因表达谱的改变。热应激反应的典型特征之一是热休克蛋白(HSPs)表达增加[1]。HSPs是细胞核内高度保守的热休克基因编码的产物，主要作为分子伴侣参与蛋白质的折叠、转运及组装等过程，能恢复或加速清除细胞内已变性的蛋白质而稳定细胞结构，细胞产生热耐受[2]。

谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸，正常情况下机体内的谷氨酰胺处于稳态平衡，但在应激状态下，机体处于高分解状态，体内谷氨酰胺快速耗竭，必须及时从外界摄取才能防止机体代谢的失衡。谷氨酰胺不仅具有营养作用，还是细胞快速生长和分化的主要燃料，能调节蛋白质的合成和分解，参与机体的免疫调节、缓解机体疲劳等[3]。研究发现，安全无毒的谷氨酰胺还是一种有效的HSP70诱导剂，补充谷氨酰胺可明显增强各种应激状态下多种细胞或组织HSP70的表达[4]，应激时补充谷氨酰胺对缓解应激损伤及损伤后修复有重要的意义。鉴于此，本研究通过谷氨酰胺诱导奶牛乳腺上皮细胞表达HSP70，观察其对高温应激所致的乳腺细胞凋亡是否具有抑制作用，以期为缓解奶牛的高温应激损伤研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 主要试剂 DMEM培养基(Gibco公司)、Gln(Amresco公司)、MTT(Amresco公司)、DEPC(Sigma公司)、Trizol试剂(大连宝生物工程有限公司)、M-MLV反转录酶(大连宝生物工程有限公司)、荧光定量PCR试剂(Zoonbio公司)、半胱天冬酶3(Caspase-3)试剂盒(上海哈灵生物科技有限公司)，其他试剂均为分析纯级别。

1.1.2 仪器 无菌操作台(苏州净化设备厂)、CO2培养箱(Banstead Internatonal 公司)、FTC 2000荧光定量PCR仪(枫岭国际有限公司)、酶联免疫仪(芬兰Ladsystem公司)、WFJ 7200型可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)、凝胶成像系统(上海天能有限公司)、流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)等。

1.2 细胞培养及处理

采用组织块法培养奶牛乳腺上皮细胞[5]，取对数生长期细胞，分为对照组(C)：37 ℃培养细胞24 h；谷氨酰胺组(G)：含8 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基培养细胞24 h；高温组(T)：正常培养的细胞置于41 ℃处理1 h，37 ℃恢复培养6 h；谷氨酰胺+高温处理组(G+T)：含8 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基培养细胞24 h，置于41 ℃处理1 h，37 ℃恢复培养0、6、12 h，分别收集各处理组细胞。

1.3 细胞存活率检测

收集各组对数生长期细胞，加入MTT培养4 h，吸去孔内培养液，加入DMSO，静置30 min，在酶联免疫仪490 nm处测定吸光值。细胞存活率=(试验组OD均值/对照组OD均值)×100%。

1.4 奶牛乳腺上皮细胞凋亡检测

采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡，统计细胞死亡率。细胞死亡率=细胞早期凋亡率+细胞晚期凋亡率/坏死率。

1.5 实时荧光定量PCR检测Bcl-2和HSP70基因表达量

从GenBank获得目的基因mRNA序列，运用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，引物序列见表1。

表1 Bcl-2、HSP70和GAPDH基因的荧光定量PCR引物

用Trizol试剂盒提取总RNA，核酸定量分析仪检测其纯度和含量，反转录获取cDNA。反应体系：SYBR MIX 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2.0 μL，ROX Dye 2.5 μL，无菌去离子水补至25 μL。

反应条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s，40个循环，反应结束仪器自动生成Ct值及熔解曲线图。样本基因的表达强度用其对应GAPDH基因的表达量进行校正，即△Ct=Ct(Bcl-2/HSP70)-Ct(GAPDH)，其相对表达量采用2-ΔΔCt法进行分析。

1.6 Caspase-3活性检测

使用Caspase-3比色试剂盒，按照使用说明检测Caspase-3的活性。

1.7 数据分析

试验结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 17.0软件中的One-Way ANOVA进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞存活率的影响

由图1可知，与对照组相比，谷氨酰胺组细胞存活率下降11.76%(P>0.05)，高温组下降48.13%(P<0.01)；与高温组相比，谷氨酰胺+高温处理组在热恢复0、6、12 h细胞存活率分别提高63.13%(P<0.01)、32.45%(P<0.05)、52.18%(P<0.01)。提示，谷氨酰胺预处理可提高奶牛乳腺上皮细胞的热耐受性，缓解热应激反应。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写

2.2 谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测细胞凋亡发现，与对照组相比，谷氨酰胺组奶牛乳腺上皮细胞早期凋亡率和晚期凋亡/坏死率均无明显变化(P>0.05)，高温组则明显增高(P<0.01)；与高温组相比，谷氨酰胺+高温处理组在热恢复0、6、12 h早期凋亡率分别下降63.28%(P<0.05)、35.00%(P>0.05)、54.84%(P<0.05)，晚期凋亡/坏死率分别下降51.06%(P<0.05)、31.09%(P<0.05)、39.88(P<0.05)(表2)。可见，谷氨酰胺可抑制热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。

2.3 谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞Bcl-2 mRNA表达的影响

实时荧光定量PCR检测奶牛乳腺上皮细胞Bcl-2 mRNA表达量，结果发现，与对照组相比，谷氨酰胺组Bcl-2 mRNA表达量提高111.51%(P<0.05)，高温组Bcl-2 mRNA表达量降低74.82%(P<0.05)；与高温组相比，谷氨酰胺组Bcl-2 mRNA表达量明显增高，约为高温组的8.4倍(P<0.01)，谷氨酰胺+高温处理组在热恢复0、6、12 h时Bcl-2 mRNA表达量分别提高3.23倍(P<0.05)、2.49倍(P<0.05)、1.89倍(P>0.05)(图2)。

表2 谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响 %

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

图2 谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞Bcl-2

2.4 谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞HSP70 mRNA表达的影响

如图3所示，谷氨酰胺组、高温组、谷氨酰胺+高温处理组(0 h)、谷氨酰胺+高温处理组(6 h)、谷氨酰胺+高温处理组(12 h)奶牛乳腺上皮细胞HSP70 mRNA表达量分别为对照组的5.91倍、6.78倍、8.28倍、11.12倍、9.18倍，差异极显著(P<0.01)；与高温组相比，谷氨酰胺组差异不显著，谷氨酰胺+高温处理组在热恢复6 h时HSP70 mRNA表达量进一步增高(P<0.05)。

2.5 谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞Caspase-3活性的影响

由图4可见，高温组Caspase-3活性极显著增加，分别为对照组、谷氨酰胺组的4.55倍(P<0.01)、6.53倍(P<0.01)；与对照组相比，谷氨酰胺+高温处理组在热恢复6 h奶牛乳腺上皮细胞Caspase-3活性显著上升(P<0.05)；与高温组相比，谷氨酰胺+高温处理组在热恢复0、6、12 h奶牛乳腺上皮细胞Caspase-3活性分别下降68.04%(P<0.01)、40.89%(P<0.05)、52.06%(P<0.01)。

图3 谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞

图4 谷氨酰胺对高温应激奶牛乳腺上皮细胞

3 结论与讨论

HSP70是HSP家族中与细胞保护关系最密切的一族，在应激状态下可显著增加，通过免疫机制、调节酶活性、影响凋亡相关基因表达等途径参与细胞凋亡的调控。HSPs表达量提高赋予机体或细胞抵抗各种应激损伤，尤其是热耐受能力。Edwards等[6]报道，细胞的耐热性取决于细胞内的HSP70含量。谷氨酰胺是一种极有潜力的HSP诱导剂，可使热应激[7]、氧化应激[8]、内毒素血症[9]等应激状态下的细胞或组织HSP70表达量增高，发挥其对应激状态下细胞或组织的保护作用。本研究发现，体外培养的奶牛乳腺上皮细胞经过8 mmol/L的谷氨酰胺诱导24 h后，HSP70表达量显著增加(P<0.01)，提高了热应激状态下乳腺细胞的热耐受性和存活力。研究发现，谷氨酰胺可诱导体外培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549细胞HSP70蛋白表达，明显抑制过氧化氢所致的A549细胞凋亡[10]。补充谷氨酰胺可抑制冷束缚应激状态下小鼠小肠黏膜细胞凋亡，从而防治肠屏障功能紊乱及其并发症[11]。因此，当细胞或机体接触非致死性应激反应后，HSP70过表达可保护其免遭应激损伤。

细胞凋亡是一种受基因调控的自身程序性细胞死亡。Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与超常表达均引起细胞凋亡，其中Caspase-3处于凋亡级联反应的下游，是多种凋亡信号传递的汇聚点[12]。Bcl-2可抑制线粒体释放细胞色素C，阻碍Apaf-1与效应分子结合，阻断细胞凋亡的级联反应[13-14]。研究报道，在HSP70保护小肠上皮细胞免受缺氧应激引起的细胞凋亡损伤试验中发现，HSP70过表达可通过促进Bcl-2表达，关闭MPTP，阻止细胞色素C释放至胞浆中，从而抑制缺氧应激引起的小肠上皮细胞凋亡[15]。本研究发现，谷氨酰胺预处理促进了奶牛乳腺上皮细胞Bcl-2 mRNA表达，缓解了高温应激引起的Caspase-3活性上升，保护细胞对抗应激损伤。Bcl-2基因家族是细胞凋亡的重要调控基因，其中Bcl-2基因具有抗凋亡作用，是细胞生存基因的代表。当Bcl-2表达量上调时，细胞免遭凋亡。Swanton等[16]研究认为，Bcl-2可抑制线粒体膜的通透性和阻止细胞色素C的释放，还通过作用于线粒体细胞色素C下游的一个关键点而先后抑制Caspase-3和Caspase-2的激活及其Caspase-3依赖的级联反应，并使细胞免于发生凋亡。小肠黏膜细胞Bcl-2的表达部位与细胞的增殖和凋亡部位关系密切，谷氨酰胺缺乏可抑制Bcl-2的合成，加重细胞凋亡，而补充谷氨酰胺可增强其表达，从而抑制细胞凋亡[11]。对Wistar大鼠研究发现，谷氨酰胺治疗能降低阻塞性黄疸肝细胞凋亡，增加Bcl-2蛋白表达量，降低Bax蛋白表达量[17]。关于谷氨酰胺促进Bcl-2表达的机制尚不清楚，有研究报道，谷氨酰胺能增强细胞膜的稳定性[18]。细胞遭受不良应激反应后，Bcl-2基因表达量增加，可能是一种代偿性反应，细胞膜结构一旦破坏，Bcl-2蛋白的结构不能得以维持，而给予谷氨酰胺则能减轻细胞的膜结构损坏，促进代偿反应的发生。但其具体的作用机制尚不明确，还有待于进一步探讨。

综上，谷氨酰胺预处理诱导了Bcl-2和HSP70基因的表达，提高了高温应激奶牛乳腺上皮细胞的热耐受性和存活力。