不同密度青蛤养殖塘异养细菌和弧菌的数量变化

郑晓叶，郑天伦，曹飞飞，朱凝瑜，丁理法，王国良

(1.浙江省水产技术推广总站，浙江 杭州 310023； 2.温岭市水产技术推广站，浙江 台州 317500； 3.宁波大学 海洋科学学院 应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211)

青蛤(Cyclinasinensis)隶属瓣鳃纲(Lamellibranchia)帘蛤科(Veneridae)环文蛤属(Cyclina)，为滤食性底栖贝类。随着青蛤规模化人工育苗技术的突破[1]，我国江苏、浙江、辽宁等地沿海青蛤规模化养殖业得到迅猛发展[2]。随着养殖历史的延长、养殖规模的逐年扩大和养殖密度的加大，养殖环境日趋恶化，致使青蛤病害问题也开始频繁发生。通州[3]、连云港[4]、温州[5]、温岭等地青蛤均出现了大规模死亡的现象，不仅给养殖户造成大量的经济损失，也阻碍了青蛤养殖产业的健康有序发展。

在养殖生态环境中，异养细菌具有重要地位和作用，与养殖生物生长的关系极为密切，是海水养殖环境研究中不可缺少的重要内容，是正确评价海水养殖生态结构与功能的重要因素[6-8]，大多数病原菌为异养细菌[9]。弧菌在水产养殖生态系统中是一类重要的条件致病菌[9]，研究弧菌数量的变动旨在监测水体中有害菌群的变动规律，对养殖生产做出指导。养殖环境中的各种理化因子之间的相互作用，将影响养殖生物的生长与繁殖，青蛤营埋栖生活，池塘水质和底质状况对其生长都极为重要。由于养殖池塘环境的自身特点，其生态平衡和结构与功能的完善通常需要依靠人工调节[10]。异养细菌数量变化可间接反映池塘环境理化因子的变化趋势，因此，养殖生产中实时监测异养细菌的数量变化，有利于池塘环境生态平衡的有效调控。国内外研究者利用传统的细菌分离培养技术结合现代分子生物学方法对南美白对虾(Litopenaeusvannamei)[11-12]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)[13-15]、九孔鲍(Haliotisdiversicolorsupertexta)[16]、海参(Apostichopusjaponicus)[17-18]、牡蛎(Crassostreahongkongensis)[19]等海水养殖动物及其养殖水体、养殖区沉积物中细菌及理化因子都有较多研究，而青蛤养殖环境异养细菌数量变化的研究尚未见报道。

本文以浙江省温岭市青蛤海水围塘养殖为对象，研究养殖塘水体、底泥及青蛤腔液中异养细菌和弧菌在不同季节的数量变化，为青蛤的健康养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 采样围塘

实验样品采集于浙江省温岭市龙王青蛤养殖场，选取池塘条件相同的6个不同放养密度、面积约13 340 m2的养殖围塘，密度梯度设置如下：4×104、6.2×104、8×104、1.57×105、1.64×105、2×105粒·667m-2，依次编号为1、2、3、4、5、6，每个密度组设1个试验塘，放养稚贝规格为60～320粒·kg-1。

1.2 样品采集与处理

采样周期为5月至12月，每月初采集一次共采样8次。样品均放置于保温冰盒中带回实验室。

1.2.1 水样

用采水器采集20～40 cm深度的水样500 mL，置于样品瓶中带回。取1 mL水样置于灭菌试管中加入灭菌海水9 mL进行梯度稀释。

1.2.2 泥样

取底泥20 g左右置于一次性无菌培养皿中，以封口膜固定培养皿带回。称取1 g底泥置于无菌离心管中，加入9 mL灭菌海水，梯度稀释。

1.2.3 青蛤

每个养殖塘选取3个采样点随机采集不少于20枚青蛤置于一次性无菌样品袋中带回。从每个样品袋中随机取青蛤10枚，取腔液置于灭菌离心管中，用灭菌海水梯度稀释。

1.3 细菌数量的测定

1.3.1 异养细菌总数

取0.2 mL梯度稀释样品置于无菌培养皿，倒入适量50%海水配制的普通营养琼脂，每个稀释梯度做2个重复，待培养基冷却凝固后倒置于28 ℃下培养48 h。取菌落数在30至300的平板进行有效计数，分别计算水样、泥样和青蛤腔液中的异养细菌总数。

1.3.2 弧菌数量

取0.2 mL梯度稀释样品置于无菌培养皿中，倒入适量TCBS培养基，每个稀释梯度做2个重复，待培养基冷却凝固后倒置于28 ℃下培养48 h，取菌落数在30至300的平板进行有效计数，分别计算水样、泥样和青蛤腔液中的弧菌总数。

1.4 数据处理

实验数据采用Excel 2010软件整理，运用SPSS 13.0软件进行数据统计分析。各塘或样品之间的差异性采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，当P<0.05时差异性水平达到显著，当P<0.01时差异极显著。相关性用Pearson相关系数表示，当P<0.05时相关性显著，当P<0.01时相关性极显著。图表绘制使用Origin 8.0完成。

2 结果与分析

2.1 水体中异养细菌数量和弧菌数量变动

如图1-A所示，采样周期中各养殖塘水体中异养细菌数量呈现不同的变化趋势，但是放养密度相近的池塘呈现相似的变化趋势，如1塘和2塘变化趋势一致，5月至9月逐渐增大，9月至12月逐渐减少。水体中异养细菌总数的变化范围为(2.5×102～5.6×105)cfu·mL-1，1塘数量最高，平均为8.8×104cfu·mL-1，3塘最低，平均为6.8×103cfu·mL-1。采样期间，3和4塘异养细菌数量变化范围不大，其余4个塘虽存在较大波动，但单因素方差分析显示，异养细菌随时间的数量变化的差异性不显著(F=1.257，P>0.05)；从空间上看，各养殖塘水体中异养细菌数量变化的差异性不显著(F=0.707，P>0.05)。

由图1-B得知，各养殖塘水体中弧菌数量呈现较为一致的变化趋势，2塘数量最高，平均为1.3×103cfu·mL-1，6塘最低，平均为2.7×102cfu·mL-1。整个采样周期中，单因素方差分析显示，各养殖塘水体中弧菌随时间的数量变化的差异性显著(F=2.673，P<0.05)，9月份水样中弧菌数量与其他月份有显著差异；从空间上看，各个养殖塘水体中弧菌数量变化差异不显著(F=0.750，P>0.05)。

2.2 底泥中异养细菌和弧菌数量变动

各养殖塘底泥中异养细菌总数的变化如图2-A所示，变化范围1.3×103～1.3×105cfu·g-1，1塘和5塘变化较大。采样期间1塘异养细菌数量最高，平均为4.3×104cfu·g-1，3塘最低，平均为1.1×104cfu·g-1；但单因素方差分析显示，各塘异养细菌总数随时间的数量变化的差异不显著(F=0.763，P>0.05)；从空间上看，各养殖塘底泥中异养细菌总数变化差异不显著(F=1.954，P>0.05)。

图1 不同月份各养殖塘水体中异养细菌(A)和弧菌(B)数量的变化Fig.1 The change trend of total heterotrophic bacteria (A) and the Vibrio number (B) in water for all ponds

各养殖塘底泥中弧菌数量变化如图2-B所示，变化范围为0～9.9×103cfu·g-1，5塘弧菌数量最高，平均为2.6×103cfu·g-1，1塘最低，平均为75 cfu·g-1。采样期间各塘底泥中弧菌数量处于较低水平(0～8.5×102cfu·g-1)，而4塘12月份弧菌数量达到1.7×103cfu·g-1，5塘11月份和12月份弧菌数量超过9.0×103cfu·g-1。从时间上看，整个采样周期中各养殖塘底泥中弧菌数量变化的差异不显著(F=0.994，P>0.05)；从空间上看，各养殖塘底泥中弧菌数量变化差异显著(F=2.605，P<0.05)，5塘与其他养殖塘底泥中弧菌数量变化差异显著。

2.3 同一池塘水体和底泥中异养细菌和弧菌数量变动

同一养殖塘水体中异养细菌总数(WT)和弧菌数(WV)及底泥中的异养细菌总数(ST)和弧菌数(SV)变化如图3所示。各养殖塘水样异养细菌总数和弧菌数量变化趋势较为一致，Pearson相关性分析显示养殖密度与水样中异养细菌总数和弧菌数量的变化均呈不显著负相关，异养细菌数量变化与养殖密度相关性为(r=-0.024，P>0.05)，弧菌数量变化与养殖密度相关性为(r=-0.126，P>0.05)，水样中异养细菌总数与弧菌数量变化呈显著正相关(r=0.335，P<0.05)；各养殖塘底泥中异养细菌总数和弧菌数量变化趋势基本一致，Pearson相关性分析显示，底泥中异养细菌总数变化与弧菌数量变化呈极显著正相关(r=0.587，P<0.01)；异养细菌总数与养殖密度呈负相关(r=-0.116，P>0.05)，弧菌数量变化与养殖密度呈正相关(r=0.181，P>0.05)，底泥中异养细菌数量变化与水体中异养细菌数量变化呈正相关(r=0.015，P>0.05)，但相关性均不显著。

2.4 青蛤腔液中异养细菌和弧菌数量变化

图4-A所示，各养殖塘青蛤腔液中异养细菌总数变化范围为95～5.9×104cfu·mL-1，最大值出现在2塘5月份，最小值出现在1塘12月份，总体上看2塘异养细菌数量最高，平均为9.8×103cfu·mL-1，4塘最低，平均为1.3×103cfu·mL-1。图4-B所示，各养殖塘青蛤腔液中弧菌数量变化范围为0～2.1×103cfu·mL-1，最大值出现在2塘6月份，最小值出现在1塘5月份，总体上看2塘弧菌数量最高，平均为387.5 cfu·mL-1，4塘最低，平均为75 cfu·mL-1。方差分析显示，不同采样时间同一塘的青蛤腔液异养细菌总数差异极显著(F=4.203，P<0.01)，5月和6月份样品与其他月份青蛤腔液中异养细菌总数差异显著；不同采样时间弧菌数量差异较为显著(F=2.881，P<0.05)，5月与其他月份青蛤腔液中弧菌数量差异显著。Pearson相关性分析显示青蛤腔液异养细菌总数与养殖密度相关性极显著(r=-0.189，P<0.01)，弧菌数量与养殖密度相关性极显著(r=-0.123，P<0.01)。

图2 不同月份各养殖塘底泥中异养细菌(A)和弧菌(B)数量的变动Fig.2 The change trend of total heterotrophic bacteria (A) and the Vibrio (B) number in sediment for all ponds

图3 同一养殖塘水样、底泥中的异养细菌总数和弧菌数量变化Fig.3 The change trend of total heterotrophic bacteria and the Vibrio number in each ponds

3 讨论

养殖塘异养细菌数量变动与养殖塘中有机质、浮游生物、温度、及水体营养盐状况等密切相关，是养殖塘物理、化学和生物因子综合作用的结果。由于异养细菌是典型的基质限制性生物，其个体微小、繁殖速度快、生命周期短，因而养殖塘的理化及生物因子的变动容易对异养细菌产生影响。国内外学者对南美白对虾[11-12]、大黄鱼[13-15]、九孔鲍[16]、海参[17-18]、牡蛎[19]等海水养殖动物及其养殖水体、沉积物中的异养细菌及其菌群结构进行了研究，因养殖环境不同其相应环境水体中异养细菌数量亦有差异。本研究中青蛤养殖塘水体中异养细菌总数的变化范围为(0.025～57.5)×104cfu·mL-1，与仿刺参、牡蛎养殖水体中的异养细菌总数变化范围基本一致[16，19]；青蛤养殖塘底泥中异养细菌总数变化范围为1.3×103～1.3×105cfu·mL-1，低于明显低于对虾围塘底泥中总细菌数[20-21]，后者采用吖啶澄染色荧光显微直接计数法统计样品中的细菌总数，本实验统计异养细菌总数，不包含环境中非可培养细菌。

图4 不同月份各养殖塘青蛤腔液中异养细菌(A)和弧菌(B)数量变动Fig.4 The change trend of total heterotrophic bacteria (A)and the Vibrio (B) number in Cyclina sinensis cavity fluid for all ponds

随着近年来青蛤养殖技术的成熟，青蛤养殖规模不断扩大，养殖密度也不断增加，然而养殖密度过高必然会带来一系列的养殖问题，故探索适宜的养殖密度是青蛤海水围塘生态养殖可持续发展的必然选择。本研究监测检测了不同密度养殖塘水体和底泥中弧菌的数量变化，发现水体和底泥中弧菌数量的变化与样品中异养细菌总菌的变化显著相关，水体中弧菌数量与养殖密度呈负相关而底泥中弧菌数量与养殖密度呈正相关，这与贝类强大的滤水能力和生物沉降作用有关。另外，水体中的异养菌总数和弧菌数量受季节影响较大，在夏秋高温季节水体中异养细菌总数明显增高，这主要是受水温影响，而底泥中的异养细菌和弧菌数量则受营养盐累积的影响较大。Wang等[19]研究发现牡蛎养殖水体的异养细菌及弧菌变化趋势与体腔液中变化一致，只是降了两个数量级，本试验监测检测了青蛤腔液中异养细菌总数和弧菌数量，发现二者与青蛤养殖密度呈显著负相关，与养殖水体中的菌数变化趋势一致且降低了一个数量级。养殖贝类的微生物性疾病研究表明，青蛤发生细菌性疾病可能由多种弧菌共同感染所致，而养殖环境的改变容易致使弧菌大量繁殖，引起疾病的发生和蔓延[22-23]。

随着我国浅海和滩涂贝类养殖业的迅速发展，贝类养殖环境恶化，易致使病害发生，而由于贝类底栖埋栖的生活特性，容易造成病害的大面积蔓延而且会进一步破坏底质，因而对贝类养殖环境的监测不仅有利于了解贝类生长过程中对环境的改变而且有利于掌握贝类生长适宜的环境条件。本研究发现，青蛤养殖密度对养殖塘底泥、水体中的异养细菌总数和弧菌数量变化无显著影响，而与青蛤腔液中异养菌数和弧菌数量变化相关性极显著，表明高密度养殖虽然短期内对水体和底泥菌群变化影响不大却会影响青蛤的健康生长。另外，经过有效指导和合理管理，在青蛤养殖过程中试验塘未有病害发生，说明本实验选取青蛤养殖密度都在养殖环境容量之内。青蛤养殖密度适宜，加强管理，加大经济效益的同时注重生态状况，可推动青蛤养殖业更加健康有序发展。