一株草莓连作自毒障碍主要物质苯甲酸降解细菌的筛选及其降解效果研究

刘紫英，黄 磊，袁 斌，刘小林，*，徐胜光，黄 涛

(1.宜春学院 化学与生物工程学院，江西 宜春 336000； 2.宜春第九中学，江西 宜春 336000； 3.宜春学院 生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000； 4.昆明学院 云南省都市特色农业工程技术研究中心，云南 昆明 650214)

当前制约我国草莓规模化生产的主要原因之一依然为连作障碍[1]，而连作障碍的主要原因是草莓自毒作用。草莓自毒引起土壤养分失衡和土壤微生物区系失调，同时根系分泌物中积累了大量有毒物质[2]，因此研究根系自毒物质对栽培作物产量的影响是当今研究的有效途径[3]。草莓根系分泌物中有一些化感物质具有自毒作用[4]，而苯甲酸在化感物质中含量很高，毒性较强[5]。草莓根系自毒物质的加速降解或活性降低，会有助于控制草莓连作障碍的发生，筛选和开发微生物修复剂是解决作物连作障碍的热点[6]。有研究表明，Erwineaherbicola[7]、Microbacteriumhydrocarbonoxydans[8]、Eubacteriumoxidoreducens[9]、Ochrobactrumsp.[10]等菌株可有效降解细菌。本研究筛选苯甲酸高效降解菌株，同时检测其与草莓根腐病原的拮抗性，筛选到解毒抗菌双重功能的菌株；探讨利用细菌降解草莓自毒物质的可行性，为草莓连作障碍的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试草莓的品种为威州草莓。

供筛选降解菌株的土样：于2016年11月28日取自江西省宜春市袁州区宜春学院正大门前方两个草莓种植大棚，其中连作10年和3年的草莓种植大棚均采取五点取样法，每点取3个样品，各取15份10～15 cm土样。

F403尖孢镰刀菌Fusarium.oxysporum(序列号MG515306)、F405腐皮镰孢Fusariumsolani(序列号MG515307)、F407黄色镰孢Fusariumculmorum(序列号MG515308)均为草莓根腐病病原，系宜春学院微生物实验室保存的菌株。

1.2 主要试剂和仪器设备

供试苯甲酸分析纯(天津永大化学试剂有限公司出产)。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、2×EasyTaqPCR SuperMix、Marker 2000 ladder、16S rDNA扩增引物(27F: 5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′，1541R: 5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)均购自生工生物工程有限公司。

PH100-DB00U-IPL数码显微镜，江西凤凰光学集团有限公司；TGL-16G台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；752N紫外可见光分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；T100梯度PCR仪，Bio-Rad。

1.3 培养基

改良无机盐培养基：(NH4)2SO42 g·L-1，Na2HPO41.3 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，苯甲酸100～2 000 mg·L-1，NaCl 5 g·L-1，余量为蒸馏水；pH为7.2。

1.4 降解菌株的富集和分离

采用富集培养的驯化方法，将连作10年草莓种植大棚地(L1、L2、L3、L4、L5)和连作3年草莓种植大棚地(R1、R2、R3、R4、R5)随机取样10 g后接种入苯甲酸作为唯一碳源的基础无机盐液体培养基中。浓度梯度：L1和R1为100 mg·L-1、L2和R2为200 mg·L-1、L3和R3为300 mg·L-1、L4和R4为400 mg·L-1、L5和R5为500 mg·L-1，两个对照组不接入土样。在前期进行预实验筛选后，设定140 r·min-1、37 ℃摇床振荡培养7 d，然后将平板涂布于固体培养基，培养皿于37 ℃培养72 h，然后挑取单个菌落，进行纯化培养。

1.5 降解菌株的筛选与鉴定

1.5.1 初筛

平板涂布之后，观察固体培养基菌落生长情况，将长势较好的固体培养基菌落进行单菌落挑选实验，每株菌重复3次，将筛选纯化培养得到的菌株分别进行编号(L101、L102、……L501、L502、L503；R101、R102、R103……R501、R502、R503)。

1.5.2 复筛

将初筛获得的降解菌株移接到三角瓶液体培养基中，培养基含(NH4)2SO42 g·L-1，Na2HPO41.3 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，苯甲酸 100～2 000 mg·L-1，NaCl 5 g·L-1，余量为蒸馏水；其苯甲酸浓度为1 000 mg·L-1，接种初筛降解菌(1×107cfu·mL-1，加上菌液浓度)量为每瓶1 mL，对照为1 mL无菌水，设定140 r·min-1、37 ℃摇床振荡培养7 d，观察其生长情况，检测苯甲酸残留量。

1.6 降解菌菌株对苯甲酸的降解测定

1.6.1 苯甲酸标准曲线的测定

取苯甲酸标准液0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，分别加入到100 mL容量瓶中，加少量蒸馏水摇匀，然后用蒸馏水定容，以零管作参照对比，用石英比色杯在波长230 nm下分别测定其吸光度(D230)，以吸光度(D230)为纵坐标，横坐标为苯甲酸标准液的浓度，绘制标准曲线。

1.6.2 样品中苯甲酸残留量的测定

在液体培养基振荡培养7 d的过程中，期间每隔24 h，取出5 mL培养液加入到10 mL无菌离心管中，8 000 r·min-1，25 ℃，离心8 min后过滤(0.22 μm)，去掉菌体即为待测液。选用紫外可见分光光度法，用石英比色杯装待测液在波长230 nm下测定其吸光度(D230)，根据吸光度(D230)和苯甲酸标准曲线计算样品中苯甲酸的残留含量。

1.7 降解菌对草莓根腐病的皿内拮抗作用

将复筛获得效果最好的降解菌在LB培养液中振荡培养140 r·min-1，48 h后以10 000 r·min-1速度离心5 min，0.2 μm滤膜过滤得上清液备用。

F403尖孢镰刀菌 (Fusariumoxysporum)、F405腐皮镰孢(Fusariumsolani)、和F407黄色镰孢(Fusariumculmorum)接种于PDA斜面，28 ℃培养5 d，加入无菌水，刮下孢子混匀成孢子悬浮液(1×107mL-1)。将悬浮液加入100 mL融化冷却至45 ℃左右的PDA培养基中，摇匀后制成含根腐病原菌的PDA平板。

凝固后在含病原菌PDA平板中间用无菌打孔器打孔，并取已过滤的降解菌L501 100 μL，28 ℃培养5 d，十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.8 降解菌的鉴定

对最佳降解菌株L501进行形态学和革兰氏染色的微观形态观察，并测定其16S rDNA序列，选用通用引物进行PCR扩增，由生工生物工程公司进行测序分析。将测序结果提交NCBI网站的GenBank，采用BLAST比对，并用MEGA6.0软件构建菌株系统发育树，NJ算法，自展次数设定为1 000；结合《常见细菌鉴定手册》鉴定菌株L501[11]。

2 结果与分析

2.1 降解菌株的筛选及对苯甲酸的降解率

由苯甲酸标准曲线得吸光度与苯甲酸浓度关系为：y=0.005x+0.006，R2=0.999(图1)。由表1可以看出，分离纯化出的67株菌株中有9株对苯甲酸均具有降解能力，分别为L203、L302、L403、L501、L502、R401、R402、R403、R503，其降解率在168 h时分别为13.3%、17.1%、43.2%、87.5%、40.8%、49.5%、46.1%、57.3%、42.7%，其中L501最高，为87.5%。

经过7 d的培养，9株降解菌对苯甲酸的降解率为13.3%～87.5%，说明从草莓根部土壤分离筛选出的菌株对苯甲酸具备有效降解能力。复筛结果表明，L501降解苯甲酸的能力最强，因而以L501做拮抗实验和鉴定。

2.2 降解菌对草莓根腐病的皿内拮抗作用

降解菌株L501的发酵液表现拮抗活性，结果如表2。其中，对F405腐皮镰孢Fusariumsolani菌株的生长具有很强的抑制作用，拮抗圈直径达15.0 mm，对F403尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum拮抗直径为14.5 mm；降解菌株L501对草莓根腐病菌F407黄色镰孢Fusariumculmorum拮抗直径为11.0 mm；且透明度都很好。综上，降解菌株L501对草莓根腐病有较好的抑制作用。

2.3 降解菌株L501的鉴定

L501在168 h时对苯甲酸的降解率达到最高，降解率为87.5%。形态学观察表明，降解菌菌落为乳白色，近圆形，边缘光滑湿润，稍具小齿，齿，表面皱褶，中部隆起。光学显微镜下可以观察到菌株为革兰氏阳性菌，为短杆菌；芽孢中生，稍膨大(图2)。

图1 苯甲酸标准曲线Fig.1 Standard curve of benzoic acid

表1九株降解细菌对苯甲酸降解率及苯甲酸的残留量

Table1Degradation rate of benzoic acid by 9 strains of degrading bacteria and residual benzoic acid

降解菌编号Number指标Score降解时间Degrading time/h24487296120144168L501残留量Residual content/(mg·L-1)375.9256.0247.0206.5170.5118.062.5降解率Degrading rate/%24.848.850.658.765.976.487.5L502残留量Residual content/(mg·L-1)382.1315.9298.6295.8237.5207.9160.9降解率Degrading rate/%23.636.840.340.852.558.467.8R403残留量Residual content/(mg·L-1)287.6265.3190.7183.6179.3175.2170.8降解率Degrading rate/%28.133.752.354.155.256.257.3R401残留量Residual content/(mg·L-1)267.4249.8208.3205.7203.6202.6201.9降解率Degrading rate/%33.237.647.948.649.149.449.5R402残留量Residual content/(mg·L-1)281.9256.3219.5218.9217.3216.8215.6降解率Degrading rate/%29.535.945.145.345.745.846.1L403残留量Residual content/(mg·L-1)297.2261.8235.1230.6228.3227.6227.3降解率Degrading rate/%25.734.641.242.442.943.143.2R503残留量Residual content/(mg·L-1)388.7357.1303.8297.5294.1287.9286.7降解率Degrading rate/%22.328.639.240.541.242.442.7L302残留量Residual content/(mg·L-1)268.1256.3253.9251.7250.1249.4248.7降解率Degrading rate/%10.614.715.416.116.616.917.1L203残留量Residual content/(mg·L-1)186.2181.6179.5177.3176.5174.8173.4降解率Degrading rate/%6.99.210.311.411.812.613.3

表2L501对3种草莓根腐病病原菌的拮抗圈直径

Table2Diameters of the inhibitory zones of strain L501 against three strawberry root rot

降解菌Degrading bacteria草莓根腐病病原菌Pathogenic fungi of strawberry root rot拮抗圈直径Diameters of the inhibitory zones/mm透明度TransparencyL501L501L501F405 Fusarium solaniF403 Fusarium oxysporumF407 Fusarium culmorum15.014.511.0+++++++++

分子鉴定菌株L501的16S rDNA序列长度为1 456 bp，提交GenBank，获得序列号为MG519283，用NCBI网站中BLAST程序进行L501的序列与其相似性极高的序列比较分析，与降解菌L501的16S rDNA序列同源性在99%以上的菌株均为Bacillussubtilis，初步将此菌株归为芽孢杆菌属，选GenBank中与L501菌株相似性较高的5个菌株构建系统进化树，结果如图3所示。综上，依据16S rDNA序列相似性分析，结合菌株L501形态结构观察，对照《常见细菌鉴定手册》，鉴定菌株L501为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。

图2 菌株L501显微特征(1 000×)Fig.2 Morphological characters of the strain L501(1 000×)

3 结论与讨论

研究表明，对草莓连作自毒作用的降解菌多为放线菌，如解灵军等[12]报道的对羟基苯甲酸降解菌菌株B3512和毛宁等[13]报道的淡紫褐链霉菌、Streptomycessp.。研究显示，降解菌制成的放线菌制剂能有效减轻草莓连作的自毒作用。孙敬祖等[14]研究表明，放线菌可以定殖在草莓根表，并在草莓连作障碍修复中起到防病促生作用。

图3 菌株L501的16S rDNA序列构建系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of the stain L501 based on 16S rDNA sequence

关于细菌对作物连作自毒作用的降解作用研究也有些报道。方艳芬等[15]研究表明，对苯甲酸的降解效果较好的细菌有假单胞菌、不动杆菌及产碱杆菌属。而细菌作为草莓连作自毒作用的降解菌却鲜见报道。何志刚等[16-17]通过研究表明，枯草芽孢杆菌作为花生和番茄自毒物质降解菌，对肉桂酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸和水杨酸都有较强的降解力，同时，它具有较强的拮抗能力，对根腐菌和Aspergillusflavus有拮抗作用，这是一种有潜力的生物防治菌。研究显示，枯草芽孢杆菌是得到国内外学者青睐的一种生防细菌，并已开发成相关生防试剂投放到市场[18]。枯草芽孢杆菌作为生防菌能够抑制草莓根腐病菌尖孢镰刀菌和草莓枯萎病菌[19-20]。

本研究表明，筛选得到一菌株L501枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，而且其对草莓根系分泌物中的主要有害化感物质——苯甲酸有较强的降解作用，并能够有效拮抗草莓根腐病菌。L501枯草芽孢杆菌系草莓根泌自毒物质苯甲酸的降解菌，具有成为草莓根腐病的生防菌潜力，可用于修复草莓重茬。本研究仅探索该菌株对苯甲酸的降解力，而其对混合酚酸类或其他自毒物质的降解能力以及在田间的实际修复效果，尚需进一步深入研究。