西红花中苦藏花素的分离及抑菌研究

陈天翱，陈封政

（1.四川省乐山第一中学校，四川乐山 614000；2.乐山师范学院 化学学院，四川乐山 614000）

西红花（Crocus sativus L.）为鸢尾科番红花属植物的干燥柱头，主产于印度、伊朗、西班牙和意大利等[1]。西红花于唐代时由印度经西藏传入我国，故西红花又称为藏红花、番红花，目前西红花在我国江浙一带有大面积栽培。西红花药用历史悠久，具有活血化瘀、解毒安神、凉血解毒等功效[2]，但西红花产量极低，有报道称10万株西红花才能产生1千克柱头，故西红花价格昂贵，有“植物黄金”之称[3]。西红花的主要活性成分和特征成分为西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ，《中华人民共和国药典》（2015年版）以西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的总含量为指标成分。栀子是一种廉价的中药材，该药材中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含量很高[4]，故一些不法商人就向西红花提取物或含有西红花的产品中人为掺杂栀子或从栀子中分离出的西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ来以次充好。为了从西红花中寻找更特征的成分，对西红花的成分进行了研究，分离得到了一纯品化合物，经核磁鉴定该化合物为苦藏花素，并进行了抑菌活性测试。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西红花，购自乐山市康发药业有限公司（产地：西藏），产品批号1604407；左氧氟沙星，购自百灵威科技有限公司；菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli），均由乐山师范学院微生物室提供；培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

干燥箱、培养箱、移液枪、高压灭菌锅、超净工作台、真空抽提器、循环水真空泵、旋转蒸发仪、GeLai制备液相色谱、Waters色谱仪、Varian INOVA 400核磁共振谱仪。

1.2 试验方法

1.2.1 苦藏花素的提取与纯化

称取100 g西红花，用500 mL乙醇室温浸泡提取6天，过滤；滤渣再次用500 mL乙醇室温浸泡提取6天，过滤，合并滤液。在50 ℃条件下减压浓缩滤液至膏状，用水将膏状物制成50 mL溶液，先用普通滤纸过滤，滤液再用0.45 μm的滤膜过滤，得到样品的制备液。将该制备液一次性吸入制备液相色谱柱，以乙腈-水为流动相梯度洗脱：运行时间60 min。0 min时，乙腈含量为10%，60 min时，乙腈含量为70%；流速20 mL/min，检测波长220 nm，按照峰收集洗脱液。经过多次制备分离，得到一纯度较高组分，然后以分析液相色谱仪检测该化合物纯度。

1.2.2 苦藏花素的结构鉴定

以氘代甲醇为溶剂，用Varian INOVA 400核磁共振谱仪进行核磁测试，通过核磁共振氢谱和碳谱图解析目标化合物的结构。

1.2.3 苦藏花素抑菌活性的测定

1.2.3.1 菌悬液的制备

根据参考文献[5]，分别制备金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌浓度为107个/mL的试验菌悬液，备用。

1.2.3.2 抑菌试验

用移液枪精密吸取各种菌悬液0.2 mL放入培养基中，用无菌三角玻璃涂布棒将菌悬液涂抹均匀。将灭菌的滤纸圈（滤纸圈直径为5 mm）在0.5 mg/mL的样品中完全浸透，然后将滤纸圈覆盖在培养基上，将培养皿置于生化培养箱中，37 ℃条件下培养24 h，用游标卡尺测定抑菌圈的直径。阳性对照为左氧氟沙星（0.5 mg/mL）；阴性对照为无菌蒸馏水。每组实验设3次重复，抑菌圈直径取平均值。

2 结果与讨论

2.1 苦藏花素的制备

从100 g西红花中制备分离出一纯度较高组分，浓缩后得到化合物25 mg，以分析液相色谱仪检测该目标化合物纯度为94%（检测条件：检测波长220 nm，流速1 mL/min，洗脱液：乙腈-水，设定时间为20 min，0 min时，乙腈比例为10%，20 min时，乙腈比例为60%），见图1。从图1可以看出，该目标化合物中仍含有少量杂质，这些杂质的出峰时间分别为5.42 min、7.98 min和13.44 min，从出峰时间可以看出，主要杂质（出峰时间分别为5.42 min和7.98 min）的极性比目标化合物强，次要杂质（出峰时间为13.44 min）的极性比目标化合物弱，三种主要杂质的总含量低于6%，单个杂质的含量约为目标化合物的2%，故做核磁测试时，杂质不会影响该目标化合物的鉴定。

图1 苦藏花素的HPLC纯度

2.2 苦藏花素的鉴定

通过核磁测试得到该化合物的核磁共振氢谱图（图2）和碳谱图（图3）。通过核磁共振谱可以看出，δH10.08（1H, s）和δC192.4为明显的醛基信号；δH1.18（3H, s），1.16（3H, s） 与 δC29.1，27.8为碳上角甲基信号，且化学位移相近，性质相似；同样δH2.10（3H, s）与δC19.2亦为碳上角甲基信号；δC154.3和δC139.5是一组双键碳信号；δC101.3，77.2，77.2，73.9，70.5，69.7，61.5 是一个六碳糖的信息，其中δC101.3是糖上的端基碳。这些数据与文献[6-7]报道的苦藏花素的核磁数据基本一致。故该化合物鉴定为苦藏花素（picrocrocin），其结构式如图4，其氢谱和碳谱数据归属见表1。

图2 苦藏花素的核磁共振氢谱

图3 苦藏花素的核磁共振碳谱

表1 苦藏花素的NMR数据

图4 苦藏花素的结构

2.3 苦藏花素抑菌活性试验结果

以左氧氟沙星为阳性对照，以无菌蒸馏水为阴性对照，采用抑菌圈法测定化合物的抑菌活性。抑菌圈直径越大表示化合物的抑菌活性越强。抑菌实验测量数据见表2。

从表2可以看出，苦藏花素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均有抑制作用，尤其对枯草芽孢杆菌的抑制作用更强，但活性均弱于阳性对照左氧氟沙星。

表2 苦藏花素的抑菌圈直径

3 结论

对西红花成分进行成分分离，得到了纯品，通过核磁共振技术鉴定为苦藏花素，并通过抑菌圈法研究了该化合物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌活性，结果显示苦藏花素对三种菌都有抑菌作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑菌活性略强。

西红花临床用途很多，用于治疗心血管病、心脏病、肝病、癔症、中风、痈肿等疾病。现代药理报道西红花的生理活性很多，如抗肿瘤、抗氧化和降血脂等[8]。通过对苦藏花素抑菌活性研究，显示西红花具有抑菌作用，该研究为扩大西红花的使用范围奠定了理论基础。