植物生长调节剂对贵州镇远野百合组织培养的影响

任峻，宋迎亚

（凯里学院大健康学院，贵州凯里 556011）

百合（Lilium brownii var. Viridulum）为百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生草本球根植物，是一种集观赏、食用、药用、化妆为一体的花卉[1]。对于百合的组织培养始于20世纪50年代，Robb首先利用百合鳞片进行组织培养获得成功[2]。我国在20世纪80年代初开展了百合的组织培养研究[3-5]，为百合组织培养研究奠定了基础[2]。在组织培养技术之前，均采用传统的鳞茎球繁殖方法，繁殖速度缓慢，特别是经多代繁殖以后，常造成种性退化，甚至病毒积累，影响百合的产量和质量[6]。实现百合种球组织培养是一项有效途径[7]，既能缩短繁殖周期，增加繁殖系数，又能减少病毒侵害几率[8]。可见，开展百合组织培养育苗工作十分必要。目前还没有对产自贵州镇远的野百合的研究报道，本研究以贵州镇远百合鳞片为材料进行了组织培养，为百合种球的生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用生长健壮、无病虫害的野百合鳞茎，本实验所用百合采自贵州黔东南州镇远县羊场镇，2017年11月采集自然生境生长的野百合鳞茎，采集回来种植在实验园地，随时取用。取用百合鳞片作为本次试验的外植体。

1.2 实验器材与试剂

海尔冰箱（BCD-268TN）、光照恒温培养箱（G2X250C）、全自动数显立式高压灭菌器（YXQ-LS-755Ⅱ）、超净工作台（JH-1S）、电磁炉（SK2002）、赛多利斯天平（BSA124S）、pH测定仪（TEW-Ⅲ）等。

1.3 实验方法

1.3.1 配制培养基

配制MS基本培养基母液，称取NH4NO31600 mg、KNO31900 mg、CaCl2·2H2O 440 mg、MgSO4·7H2O 370 mg、KH2PO4170 mg、KI 0.83 mg、H3BO36.2 mg、MnSO4·H2O 16.9 mg、ZnSO4·7H2O 8.6 mg、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg、CuSO4·5H2O 0.025 mg、CoCl2·6H2O 0.025 mg、Na2EDTA·2H2O 37.3 mg、FeSO4·7H2O 27.8 mg、甘氨酸 2.0 mg、盐酸硫胺素0.4 mg、盐酸吡哆醇 0.5 mg、烟酸 0.5 mg、肌醇100 mg、蔗糖30 g，加蒸馏水溶解，定容至1 L，pH调节至5.7。按照实际需求稀释培养基母液。配制母液需要用刚制备的蒸馏水，以保证母液浓度的准确性，配好的母液需清澈透明才能使用。培养基经高压灭菌后pH值一般要降低，所以在灭菌前调pH值时要相应调高0.1～0.2。

1.3.2 灭菌

将配制好的培养基趁热分装到培养瓶中（33 mL/瓶）。把烧杯（1000 mL、500 mL、250mL、100mL各1个）、培养皿（100mm一套）、滤纸、枪形镊、解剖刀等实验用品分别用报纸和橡皮筋包扎好，整齐规范地放入全自动数显立式高压灭菌器中，121℃、101kPa灭菌20 min。

1.3.3 准备实验材料

将采集的百合鳞片用洗洁精轻轻清洗一遍，用大量自来水清洗数遍，直到水清澈明亮，沥干水备用。

1.3.4 接种

用75%的酒精对超净工作台台面进行消毒，打开紫外灯和通风开关，将接种所需要的材料和用具放入超净工作台灭菌。灭菌后开始接种，首先用75%的酒精喷洒双手，把已洗净沥干水的百合鳞片放入烧杯中，用75%的酒精消毒15 s，无菌水冲洗5次，再用0.1%的次氯酸钠溶液消毒8 min，无菌水冲洗5次，最后用0.1%升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗5次，消毒时要让消毒液将百合鳞片完全浸泡。消毒完后沥干水放入垫有无菌滤纸的培养皿中，在点燃的酒精灯旁将百合鳞片切成1mm×1mm大小的外植体，用枪形镊接种到培养瓶中，每瓶接种3个外植体。再次接种前需要将解剖刀和枪形镊放在酒精灯外焰上灼烧，避免其所带的细菌在接种过程中污染外植体，影响实验结果。

1.3.5 培养

1.3.5.1 愈伤组织诱导培养

愈伤组织诱导培养基配方为MS+NAA+6-BA+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，对NAA、6-BA设置了6个不同的浓度梯度（见表1），将鳞片外植体接种于该培养基中进行培养，重复3次。

1.3.5.2 不定芽分化培养

不定芽分化培养基配方为MS+NAA+6-BA+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，对NAA、6-BA设置了6个不同的浓度梯度（见表1），选择长势良好、颜色黄、块大的愈伤组织，切为正方形小块，接种到配制好的分化培养基中进行不定芽分化培养。

1.3.5.3 生根培养

生根培养基配方为MS+NAA+6-BA+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L，对NAA、6-BA设置了4个不同的浓度梯度（见表1），将长势好、高1～3 cm的不定芽接种到生根培养基中诱导生根。

1.3.6 培养条件

把接种好外植体的培养瓶放入光照恒温培养箱中培养，光照12h/d，光照强度2000lx，温度25℃。

1.4 实验数据统计与分析

诱导率=诱导个数/总个数；分化率=分化个数/总个数；用方差分析（One-way ANOVA）分别检验诱导率、分化率和生根率的总体差异性，用LSD法比较组间差异性。

表1 不同培养基外源激素用量（单位：mg/L）

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导培养结果分析

诱导个体每组3个重复，每个重复90个诱导个体。愈伤组织萌发率在6组激素之间存在显著的差异性（F=1248.60，df=5，p＜0.001，One-way ANOVA），萌发率由⑤、③、⑥、④、①、②依次显著降低，如图1所示。实验结果表明，1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA为诱导镇远野百合愈伤组织的最佳激素组合，而激素1.5mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA最不适合诱导镇远野百合生长愈伤组织。

图1 愈伤组织诱导培养诱导率

2.2 不定芽分化培养结果分析

不定芽长势在6组激素之间存在显著的差异性（F=4850.06，df=5，p＜0.001），长势④、（③=⑥）、⑤、②、①依次显著下降，如图2所示。实验结果表明，激素组1.5mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA比较适合分化镇远野百合不定芽生长，而激素组1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA不适合分化镇远野百合不定芽生长。

2.3 生根培养结果分析

根长势在4种培养基中之间存在显著的差异性（F=279.74，df=3，p＜0.001），根长势由③、②、④、①依次显著变差，如图3所示。实验结果表明，激素组别1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA比较适合镇远野百合生根，激素组别1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA不适合镇远野百合生根。NAA的浓度不宜太高，太高不利于根的生长，综合来看，NAA的浓度在1.0mg/L 比较合适。

图2 不定芽分化培养分化率

图3 生根培养生根率

3 结论

植物组织培养中的基本培养基有很多种，选择正确的基本培养基是成功的起点。本实验中选择的MS基本培养基是植物组织培养中最常用的培养基。而植物组织培养中的外源激素种类也很多，选择NAA、6-BA这两种外源激素作为本次实验的外源激素，是因为这两种外源激素在植物组织培养中的应用较多，生长素在组织培养中的主要作用是诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形成的控制条件，决定着发育的方向，是愈伤组织、长芽还是长根。通过实验对比得知，在植物生长调节剂对镇远野百合组织培养的影响中，诱导镇远野百合愈伤组织生长的最佳培养基配方为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；最佳不定芽分化培养基配方为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；最佳生根培养基配方为MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。其他的基础培养基及其他的激素浓度配比也有适合的可能，这需要进一步实验研究。