吴茱萸碱抑制NOD1通路诱导肝癌HepG2和SMMC-7721细胞凋亡

郭星娴，李晓朋，吕晓婷，陈 益，周 鹏，吕艳伟，李 静，陈地龙，2

(1. 重庆医科大学基础医学院组织细胞工程与干细胞研究室，组织学与胚胎学教研室，重庆 400016；2. 三峡医药高等专科学校，重庆 400016)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的高发恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中位于第3位，其发病率及死亡率居高不下。HCC具有起病隐匿、进展快、易转移、预后差、易复发等特点[1]。因此，探索如何有效治疗HCC依然是现今的研究热点之一。作为天然产物的中药具有毒副作用小、不易产生耐药性、减轻患者的痛苦等优势[2]，因此，使用中药治疗肝癌受到了越来越多的重视。吴茱萸碱是吴茱萸的主要有效成分之一，药理学研究表明，吴茱萸碱的药理作用广泛，其在抗肿瘤、抗炎、调节免疫等方面的作用十分重要[3]。有研究显示，吴茱萸碱通过抑制核转录因子κB(nuclear factor κB ,NF-κB) p65的激活，发挥强大的抗炎和抗肿瘤效应[4]。

先天免疫系统由一些能够识别微生物、病毒或异常受损的宿主细胞的受体家族组成。研究显示，肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能密不可分。近年发现，一种名为核苷酸寡聚域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, NLRs)家族的蛋白与先天免疫反应有关[5]，并且其中的核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1(nucleotide-binding oligomerization domain 1,NOD1)对肿瘤的发生、发展存在一定的影响[6-7]。有研究报道，NOD1可通过诱导NF-κB p65磷酸化，介导炎症反应和肿瘤的发生、发展[8]。因此，我们猜测吴茱萸碱抑制肝癌细胞中NF-κB p65的激活可能与NOD1相关，但目前尚未见文献报道。

1 材料

1.1细胞株正常肝细胞株HL-7702和人肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2，均购自中国典型培养物保藏中心(武汉)。

1.2药物与试剂吴茱萸碱(纯度98%)购自赛洛克生物科技公司；PCR试剂购自GeneCopoeia; BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、RIPA裂解液(强)、PMSF(100 nmol·L-1)、CCK-8试剂盒、Hoechst 33258染液，均购自碧云天生物技术有限公司；NOD1抗体购自Novus Biologicals；p65、p-p65抗体，均购自CST；Bcl-2、Bax、p53抗体，购自沈阳万类科技有限公司。

1.3仪器凝胶成像仪、电泳仪、电转仪、荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；高速台式离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)；倒置显微镜、倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1细胞培养正常肝细胞HL-7702培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI 1640培养液中，肝癌细胞HepG2、SMMC-7721均培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM-F12培养液中。将所有细胞放置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养，每24～48 h传代1次。

2.2CCK-8法检测细胞增殖取对数生长期的HepG2、SMMC-7721细胞，以1×109·L-1接种于96孔板，每孔200 μL。此实验设计分3组，每组5个复孔。空白对照组: 未接种细胞，仅加入DMEM-F12完全培养基；Control组:已接种细胞并常规培养；吴茱萸碱组:细胞中加入含终浓度0.25、0.5、1、2、4 μmol·L-1吴茱萸碱的DMEM-F12完全培养基。分别培养12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃孵育2 h。在450 nm处测定其光吸收值(A)。计算12、24、48 h各组细胞生长抑制率，实验重复3次。抑制率=(AControl组-A吴茱萸碱组)/(AControl组-A空白对照组)×100%。同时计算其半数抑制浓度(half inhibitory concentration，IC50)，并确定药物作用最适浓度和时间，实验重复3次。

2.3Hoechst33258染色实验取对数生长期的HepG2、SMMC-7721细胞，以1×107·L-1接种于已放置好盖玻片的6孔板，每孔3 mL。该实验分为2组，Control组：已接种细胞并常规培养；吴茱萸碱组：给予含终浓度0.5、1 μmol·L-1吴茱萸碱的DMEM-F12完全培养基。于37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h后，取出，弃培养液，加入固定液固定10 min，弃固定液，清洗后加入染液，在常温下避光染色5 min，去染色液，PBS洗涤，将贴附有细胞的盖玻片取出，放于滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，在荧光显微镜下观察，并且采集图片，实验重复3次。

2.4实时定量PCR反应(qRT-PCR) 收集正常肝细胞HL-7702、肝癌细胞HepG2、SMMC-7721，加入TRIzol震荡后，加入1 ∶1氯仿去除蛋白，加入2 ∶1异丙醇去除沉淀，提取总RNA，在260 nm和280 nm处检测浓度，并用DEPC水配平，将提取的RNA逆转录为cDNA。使用GeneCopoeia试剂，依据说明书进行操作，检测正常肝细胞与肝癌细胞中NOD1的表达水平。体系为95 ℃反应10 min，45个循环的95 ℃反应10 s，60 ℃反应20 s，72 ℃延伸15 s，设置2个复孔，以β-actin为内参进行PCR检测，实验重复3次。NOD1引物序列：正向5′-ACTGAAAAGCAATCGGGAACTT-3′,反向5′-CACACACAATCTCCGCATCTT-3′。

2.5Westernblot检测实验分组同“2.3”，培养24 h后，分别用全蛋白裂解液抽提试剂盒提取全蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各组蛋白浓度，每个样品取20 μg蛋白上样，SDS-PAGE分离蛋白，电转移至PVDF膜上；用5%脱脂奶粉封闭，4 ℃孵育一抗Bcl-2、Bax、p53、NOD1、p65、p-p65(1 ∶1 000)过夜。洗膜3次，37 ℃孵育二抗(1 ∶10 000)1 h，洗膜3次后，用ECL法检测蛋白的表达。

3 结果

3.1吴茱萸碱对HepG2、SMMC-7721细胞增殖的影响Fig 1的CCK-8检测结果显示，吴茱萸碱(0.25、0.5、1、2、4 μmol·L-1)作用于HepG2和SMMC-7721细胞12、24、48 h后，HepG2和SMMC-7721细胞的增殖均受到明显抑制，与Control组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，且吴茱萸碱对HepG2及SMMC-7721细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖性。计算12 h的IC50分别为1.8、2 μmol·L-1，24 h的IC50分别为1.1、1.3 μmol·L-1，48 h的IC50分别为0.7、0.9 μmol·L-1。故选用给予1 μmol·L-1吴茱萸碱诱导24 h进行后续实验。

Fig 1 Inhibitiory effect of evodiamine on SMMC-7721(A) and HepG2(B) cells by CCK-8 assay n=3)

3.2吴茱萸碱对HepG2、SMMC-7721细胞凋亡的影响Fig 2的Hoechst 33258染色结果显示，Control组发出均匀、淡蓝色荧光；而吴茱萸碱诱导后的各组均出现核染色质浓缩聚集、核碎裂、核边集及发出蓝白色荧光等典型的细胞凋亡形态学特征，且1 μmol·L-1吴茱萸碱组的凋亡细胞比0.5 μmol·L-1吴茱萸碱组更多。

Fig 2 Evodiamine induced SMMC-7721 and HepG2 cells for 24 h by Hoechst 33258 staining (×200)

3.3吴茱萸碱对HepG2、SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白表达的影响Fig 3的Western blot结果显示，与Control组比较，吴茱萸碱组HepG2、SMMC-7721细胞中促凋亡蛋白Bax、p53表达明显增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

3.4NOD1在正常肝细胞HL-7702及肝癌细胞HepG2、SMMC-7721中的表达Fig 4的qRT-PCR及Western blot结果显示，与正常肝细胞相比，HepG2及SMMC-7721细胞中的NOD1表达水平明显升高，提示NOD1的高表达可能是肝癌发生、发展的诱因之一。

3.5吴茱萸碱对HepG2、SMMC-7721细胞中NOD1通路相关蛋白表达的影响Western blot检测NOD1信号通路中的主要成员NOD1、p65、p-p65的变化，Fig 5结果显示，与Control组比较，吴茱萸碱组HepG2及SMMC-7721细胞的NOD1、p-p65蛋白水平明显降低，而p65表达水平不变。

4 讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，并且在全球的发病率呈明显上升趋势，其发展迅速，不易发现，并且预后较差。

Fig 3 Protein expression in SMMC-7721 and HepG2 cells after evodiamine treatment for 24 h n=3)

*P<0.05vscontrol

肝癌患者的免疫力普遍较为低下，使用常规化疗药物也有可能损伤患者的免疫功能，并且治疗成本较高。因此，寻找价格低廉，且能够在抗癌的同时提高患者免疫力的药物迫在眉睫。

吴茱萸碱为吴茱萸干燥近成熟果实中的主要有效成分之一，其抗肿瘤作用是近年来的研究热点。国内外大量研究证明，吴茱萸碱可以降低炎症因子的表达，发挥强大的免疫调节功能，并且具有较强的抑制肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞死亡和抗血管生成、抑制浸润转移作用，从而能够抑制肿瘤生长、转移[9]。目前，在临床上已有采用吴茱萸碱治疗肝癌、结肠癌等恶性肿瘤的报道[10-11]，但对其抗癌的机制研究尚未完全清楚。

本研究采用CCK-8法检测吴茱萸碱对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的增殖抑制作用。结果显示，0.25～1 μmol·L-1的药物在12、24、48 h均可明显抑制上述两种细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性。采用Hoechst染色检测吴茱萸碱对肝癌细胞凋亡的影响，结果显示，采用0.5、1 μmol·L-1吴茱萸碱诱导24 h后，肝癌细胞出现了核染色质浓集，并发出亮蓝色荧光等典型的细胞凋亡指征，且凋亡形态的变化程度与药物浓度呈正相关。

Fig 4 Analysis of NOD1 mRNA (A) and protein(B) expression in normal hepatic cell lines and

*P<0.05vsHL-7702

p53蛋白是一种抑癌基因，负性调节细胞生长，与调控细胞周期、DNA修复、细胞凋亡等重要的生物学功能有关，其过表达与肿瘤的发生、发展、转移、复发及不良预后相关。Bcl-2蛋白是一种重要的抗凋亡基因，其能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而抑制了细胞凋亡。Bax蛋白是人体中关键的凋亡基因，是Bcl-2基因家族的成员之一，其过表达可拮抗Bcl-2的作用，使细胞发生凋亡。本实验采用0.5、1 μmol·L-1吴茱萸碱作用于肝癌细胞后，与Control组相比，吴茱萸碱组肝癌细胞的凋亡相关蛋白Bax、p53表达水平增高，而抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低，且呈浓度依赖性。研究证实，吴茱萸碱可促进肝癌细胞的凋亡，但其机制尚未完全清楚。

Fig 5 Protein expression in SMMC-7721 and HepG2 cells after evodiamine treatment for 24 h n=3)

*P<0.05vscontrol

NOD1蛋白是参与人体天然免疫的胞质蛋白家族中的一员，是一种模式识别受体，在遗传上高度保守，其与一些炎症反应的发生及细胞凋亡关系密切。近年有研究发现，NOD1敲除小鼠显示出对炎症诱导的结肠肿瘤发生的敏感性增加[12]。也有研究表明，与非肿瘤组织相比，胃癌组织中NOD1受体水平明显较高[13]。后期有研究发现，MCF-7细胞中，NOD1的缺失与肿瘤生长相关[14]。研究表明，NOD1在多种肿瘤细胞中呈高表达，但在肝癌细胞中NOD1的表达水平如何，尚未见文献报道。因此，我们采用qRT-PCR及Western blot检测了正常肝细胞HL-7702、肝癌细胞HepG2及SMMC-7721中的NOD1表达水平，发现与正常肝细胞相比较，HepG2及SMMC-7721细胞中的NOD1表达水平均明显较高，揭示了NOD1的高表达可能是肝癌发生、发展的诱因之一。随后，我们用0.5、1 μmol·L-1吴茱萸碱作用于肝癌细胞后，Western blot检测发现，与Control组相比，NOD1的蛋白表达明显降低。那么，吴茱萸碱是如何通过NOD1来调控肝癌细胞凋亡的呢？

NF-κB蛋白家族主要参与机体自身的免疫反应、机体损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长过程的信息传递，p65蛋白是其中的一员，其被磷酸化后进入细胞核，启动其调控作用。许多凋亡相关蛋白如p53等，都是NF-κB蛋白的靶基因产物，p53信号通路为肿瘤发生过程中诱导凋亡的重要信号通路，Bax和Bcl-2又是p53信号通路相关的重要分子，p53可通过影响Bcl-2、Bax等蛋白的表达，实现对细胞凋亡过程的调控作用[15]。因此，我们猜测吴茱萸碱可能通过下调NOD1的表达，影响NF-κB p65磷酸化，影响凋亡相关蛋白的表达来发挥其诱导肝癌细胞凋亡的作用。本实验采用0.5、1 μmol·L-1吴茱萸碱作用于肝癌细胞后，Western blot检测发现，与Control组相比，p65蛋白表达未变，但p-p65蛋白水平下降，且呈浓度依赖性。研究证实，吴茱萸碱通过下调NOD1，抑制NF-κB的激活，激活p53信号通路，改变Bcl-2/Bax的比值，诱导肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的凋亡。

综上所述，吴茱萸碱对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721有明显抗肿瘤活性，其作用机制可能与抑制NOD1通路的激活相关，因而吴茱萸碱可作为一种潜在的NOD1抑制剂，为今后开发具有抗癌作用的同时，能够提高患者免疫力，且价格低廉的药物提供了一定的参考价值。

(致谢：本研究在重庆医科大学基础医学院组织工程与干细胞研究室完成，特此感谢研究过程中给予帮助的老师及同学！)