越鞠甘麦大枣汤对HT22细胞氧化损伤的修复作用

胡杭琦，薛文达，阚明韵，王 薇

(南京中医药大学 1. 基础医学院转化系统生物学和神经科学研究中心中医脑病重点实验室、2. 第一临床医学院、3. 心理学院，江苏 南京 210023；4. 南通大学神经再生协同创新中心，江苏 南通 226001)

越鞠甘麦大枣汤在中医治疗郁证的临床运用中取得了很好的疗效，且毒副作用小[1]。前期实验发现，越鞠甘麦大枣汤能够快速修复抑郁小鼠的失乐状态[2]，其作用机制可能与上调Akt/mTOR信号通路，提高突触可塑性，以及促进神经元再生有关[3]。本研究拟采用过氧化氢(H2O2)诱导的小鼠海马神经元细胞系HT22氧化损伤模型[4-5]，探究越鞠甘麦大枣汤的保护作用，有助于指导该方的临床应用。

1 材料

1.1实验动物7 ～ 8周龄ICR小鼠，♂，体质量20～22 g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物合格证号：SCXK(苏)2014-0002。

1.2药物实验用中药材均购于南京中医药大学国医堂门诊。越鞠甘麦大枣汤由苍术100 g、香附100 g、神曲100 g、栀子100 g、川芎100 g、炙甘草125 g、淮小麦250 g、大枣375 g组成，上述药物加8倍量水浸泡30 min，沸后煎煮1 h后过滤，再加6倍量水，按上法煎煮后过滤，合并两次药液，于65 ℃减压旋蒸浓缩，浓缩后的药物浓度为8.3 g·kg-1。

Tab 1 Effects of different concentrations of Yueju Ganmai Dazao decoction serum on survival rate, LDH leakage rate, SOD and MDA of impaired HT22 cells induced by n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

1.3试剂DMEM培养液(HyClone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；胰酶细胞消化液(含酚红)(碧云天公司)；MTT(Solarbio公司)；H2O2(致远化学制剂有限公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA试剂盒，均购于南京金益柏生物科技公司。

2 方法

2.1越鞠甘麦大枣汤含药血清的制备小鼠按10 mL·kg-1的剂量灌胃给药，每日2次，连续3 d，最后1次灌胃后1 h眼球采血，分离血清，于56 ℃、30 min灭活后过滤除菌，备用。

2.2MTT法检测HT22细胞的存活率细胞呈对数生长期时，以 6×107·L-1的密度接种培养，18 h后加入H2O2(400、600、800、1 000 μmol·L-1)，处理1 h后，加20 μL MTT，4 h后加入150 μL DMSO，492 nm处检测OD值。给药组在H2O2造模后，给予越鞠甘麦大枣汤血清(1%、5%、10%)，作用24 h后，检测细胞存活率。预给药组加入不同浓度越鞠甘麦大枣汤血清(1%、5%、10%、20%)预处理24 h，再用H2O2造模1 h后，检测细胞存活率。

细胞存活率=(造模组A值-调零组A值)/(对照组A值-调零组A值)×100%

2.3ELISA法测定LDH、MDA、SOD浓度取各组细胞培养上清及细胞样品，按试剂盒说明书操作，分别测定LDH、MDA和SOD浓度。

3 结果

3.1不同浓度H2O2对HT22细胞存活率的影响不同浓度的H2O2均可明显降低HT22细胞的存活率(P<0.01)。并以600 μmol·L-1(细胞存活率49%)作为后续H2O2造模浓度。

3.2越鞠甘麦大枣汤血清对H2O2损伤的HT22细胞存活率的影响造模后，细胞存活率明显降低(P<0.01)，5%和10%越鞠甘麦大枣汤血清给药可以明显提高细胞存活率(P<0.01，P<0.05)，见Tab 1。

3.3越鞠甘麦大枣汤血清对H2O2损伤的HT22细胞LDH、SOD、MDA的影响Tab 1结果显示，造模后能明显增加LDH相对漏出量(P<0.05)，1%、5%、10%越鞠甘麦大枣汤血清给药均能明显降低LDH相对漏出量(P<0.01)，且5%给药浓度效果最好。造模后SOD活性明显降低(P<0.01)，5%越鞠甘麦大枣汤血清给药可明显增强SOD活性(P<0.01)。造模后MDA含量明显提高(P<0.05)，5%越鞠甘麦大枣汤血清给药能明显降低MDA含量(P<0.05)。

3.4预防性给予越鞠甘麦大枣汤血清对H2O2损伤的HT22细胞存活率的影响造模组与越鞠甘麦大枣汤血清预给药组的细胞存活率均明显下降(P<0.01)，但造模组与预给药组之间差异无显著性(Tab 1)。

4 讨论

本研究观察了越鞠甘麦大枣汤对于小鼠海马神经元细胞系HT22氧化损伤的修复作用，结果证实，越鞠甘麦大枣汤可以降低胞内LDH漏出率和MDA含量，提高SOD活性，而这种作用不具有预防性，提示其修复作用可能与提高抗氧化能力、抑制氧化应激有关，而其内在机制有待进一步研究。