不同处理方式的大曲真菌群落差异分析

夏 玙，罗惠波,2,*，周 平，黄 丹，邓 波，沈才萍，邬捷峰

（1.四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 643000；

2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 自贡 643000；3.劲牌有限公司，湖北 大冶 435100；4.泸州老窖股份有限公司 国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000）

作为白酒酿造的糖化发酵剂，大曲与白酒风味物质的产生、风格的形成及质量的变化密切相关[1]。由于其开放式的制作方式，大曲中的微生物类群十分丰富，包括霉菌、细菌及酵母菌等，这些微生物能够产生各种酶和风味物质，因此，微生物群落是决定大曲品质的核心因素之一[2-3]。大曲中数量巨大的微生物类群的准确描述和定义、功能菌的精准定位、微生物与白酒酿造调控技术等研究一直是白酒酿造领域的重大理论和技术问题[4-5]。在此前研究中，业内学者将分子生物学的研究融合到中国大曲微生物群落构成的探索性研究中，并取得了一定的成果。徐占成等[6]采用聚合酶链式反应-变性凝胶梯度电泳技术研究中温大曲真菌群落结构及其多样性。罗惠波等[7]利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）-单链构象多态技术研究浓香型大曲，发现在大曲发酵过程中可能是受温度变化的影响，真核微生物群落多样性呈先升高后降低，然后又升高并且基本保持稳定的特征。可见大曲真菌类群的变化因不同的发酵阶段、工艺呈不同的特点。

大曲在培菌的过程中，特别是在降温排潮期和贮存期，常会遭受曲虫的侵害[8-9]。本课题组建立外源加热的大曲热风干燥工艺，在有助排湿的同时又能有效地杀灭曲虫。而大曲在生产应用中往往要经过3～6个月贮存成为陈曲，一般地，在曲库内进行贮存也未免于曲虫的侵害。因此，另寻大曲贮存环境也是大曲制作的关注点，若在没有曲虫存在的自然条件下贮存可行，则可设置特定环境进行贮存。

为探究外源热风干燥对大曲在贮存期带来的相关影响，本研究采用实时荧光定量PCR和高通量测序技术，对排潮降温期大曲进行热风、自然干燥处理后，对比实验室贮存、曲库贮存以及自然干燥后曲库贮存不同处理方式下大曲的真菌微生物群落差异，以期为进一步优化大曲干燥工艺提供技术依据，为指导大曲热风干燥工业化应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大曲采集于四川泸州市怀玉制曲生态园，于秋季10月采样，环境温度21 ℃。

蛋白酶K、溶菌酶、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美国Sigma公司；P7589荧光定量染料 美国Invitrogen公司；AceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix Q112-02 南京诺唯赞生物科技有限公司；RNA、DNA检测试剂 美国Agilent公司；MiSeq测序试剂盒 美国Illumina公司。

1.2 仪器及设备

84Y-3型风速可控干燥箱 和成仪器仪表（昆山）有限公司；PICO 17台式高速离心机、ABI2700 PCR仪、ABI Step-One Plus实时荧光定量PCR系统 上海派森诺生物科技有限公司；Tanon 2500凝胶成像系统 上海天能科技有限公司；TGL-16台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DYY-6C型电泳仪 北京六一仪器厂；2720型PCR扩增仪 美国ABI公司；Illumina MiSeq高通量测序平台 美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集及处理

取培菌第8天排潮降温期的大曲进行最佳热风干燥处理，同时与同一曲库、同一存放地点的自然干燥大曲进行对比。热风干燥分两阶段进行，第1阶段温度为48 ℃，转换点含水率为15.5%，第2阶段温度为45 ℃。自然干燥环境与曲房温度一致，自热排潮降温。

曲库中曲虫滋生较多，与实验室贮存（几乎无曲虫）作对比。在实验室贮存和曲库中贮存均在自然温度下进行的，温度与环境温度一致。将进行热风干燥处理后的大曲分成2 批：一批大曲在热风干燥处理后直接在实验室条件下进行贮存，另一批大曲热风干燥后放回曲库中继续贮存。研究这3 种处理方式和3 种贮存方式的大曲在干燥前后、贮存1 个月、贮存2 个月时的差异。将干燥前的大曲批次（原曲）标记为RG1，将进行热风干燥处理后的大曲批次标记为FK1，将在曲库进行自然干燥的大曲批次（与热风干燥同时间的大曲）标记为ZR1；将热风干燥处理的大曲FK1直接在实验室条件下贮存1、2 个月后的大曲批次分别标记为RG2、RG3，将热风干燥处理的大曲FK1在曲库贮存1、2 个月后的大曲批次分别标记为FK2、FK3；将大曲ZR1直接在曲库贮存1、2 个月后的大曲批次分别标记为ZR2、ZR3。曲样均于-20 ℃贮存备用。

1.3.2 实时荧光定量PCR体系及程序

引物：18s_F（5’-ACTCAACACGGGAAAACTC-3’）和18s_R（5’-CGGAATGAACCAGACAAATC-3’），由上海派森诺生物科技股份有限公司提供。每个样品设3 个复孔，采用20 孔，体系：0.4 μL PCR特异引物F（10 μmol/L）、0.4 μL PCR特异引物R（10 μmol/L），10 μL 2×SYBR real-time PCR premixture，1 μL DNA模板，加水至总体积20 μL。反应程序：95 ℃、5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 个循环。10 倍梯度稀释为模板制作标准曲线。

1.3.3 目标片段PCR扩增及高通量测序

大曲总D N A提取采用改良的C T A B法，借助酶、反复冻融、酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1）抽提等操作，形成复合优化的手提方法提取大曲中微生物的总DNA[10]。用引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和2043R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）[11]扩增真菌的ITS1序列。PCR体系（25 μL）包括以下试剂：5 μL 5×reaction buffer，5 μL 5×GC buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，1 μL Forward Primer（10 μmol/L），1 μL Reverse Primer（10 μmol/L），2 μL Template DNA，0.25 μL Q5 DNA Polymerase和8.75 μL ddH2O。PCR条件：1）98 ℃预变性2 min；2）98 ℃变性15 s，55 s退火30 s，72 s延伸30 s，29 个循环；3）72 ℃延伸5 min，10 ℃到取出为止。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目标片段进行切胶回收。

基因文库测序由上海派森诺生物科技股份有限公司提供服务，用Illumina MiSeq平台进行高通量测序。

1.3.4 微生物信息分析

对有效序列的质量作进一步的评估，用于后续分析的序列[12]。将相似性大于97%的序列聚类成一个操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）[13]，并进行物种注释。与NCBI的GenBank进行BLAST比对，确定真菌序列的分类信息，获得门和属水平下的种类及相对丰度[14]。

稀疏曲线可评判当前测序深度是否足以反映该群落样本所包含的微生物多样性[15]。Alpha多样性用Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数计算，以评价大曲曲样中真菌群落的生物多样性。Beta多样性分析，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）方法，通过线性变换，将原始的高维数据降维、简化结构，从而量化样本间的差异和相似度，从中发现不同样品或样品组间的差异[16]。

1.4 数据处理及图像处理

实验所得数据采用Origin、Excel作图，SPSS 20进行方差分析，多重比较采用Duncans新复极差法进行差异显著性的分析，以P＜0.05为差异显著。GraPhlAn软件构建大曲样本总体分类等级树，R软件作生物组成热图。

2 结果与分析

2.1 实时荧光定量PCR结果分析

以4.287×108copies/μL为起始浓度，设置5 组10 倍稀释浓度的标品，制作标准曲线。标准曲线方程为：Y＝-3.144 3X+45.654，R2＝0.997 3，扩增效率为107.992%，表明不同稀释梯度定量模板的对数值和Ct值之间呈现良好的线性关系。本实验所建立的标准曲线能够准确地反映目的产物的扩增，且由样品的Ct值就可算出样品中的真菌数量。

依据标准曲线计算每克大曲样品中真菌18S rRNA基因拷贝数。如图1所示，不同处理方式大曲中的真菌18S rRNA基因拷贝数在1×1011～4.5×1011copies/g之间；ZR3拷贝数最大为4.5×1011copies/g。

图1 不同处理方式大曲中真菌18S rRNA基因拷贝数Fig. 1 Number 18S rRNA gene copies of fungal communities in different samples

2.2 不同处理的大曲真菌Alpha多样性

为获取更多大曲真菌群落多样性信息，利用Illumina MiSeq高通量测序技术对真菌ITS1进行扩增和序列比对后进行种群多样性分析和结构组成。经质量筛选后，9 个大曲样本真菌有效序列数总计有1 077 323 条，满足基本分析要求，可用于进一步的生物信息学分析。

图2 大曲样品真菌稀释曲线Fig. 2 Rarefaction curves of fungal communities in Daqu samples

根据序列数及其代表的OTU数绘制样品多样性稀释曲线，由图2可以看出，随着样品序列数的增加，可观测物种数逐渐趋于平缓，Shannon指数值也逐渐趋于饱和，这表明测序深度合理，测序结果已足够反映当前大曲样本绝大多数真菌微生物的物种信息。

不同处理方式大曲样本的真菌群类多样性结果见表1。97%水平下共得到OTU数为844，每个大曲样品的OTU数都在80以上。分析被注释到不同分类水平的真菌类群发现，大曲RG3的Chao1丰富度指数较高，Shannon和Simpson多样性指数分析表明大曲RG2、RG3、ZR3的微生物多样性较高。从工艺处理角度通过动态比较分析大曲的多样性指数发现，相比RG1，不论是通过热风干燥工艺还是自然干燥工艺对大曲进行处理后，大曲FK1与ZR1中真菌的丰富度指数均有所下降。通过比较ZR1、ZR2、ZR3的OTU、Chao1丰富度指数，发现呈先下降后上升的趋势；而进行热风干燥后的大曲，相比FK1，进行曲库贮存后的大曲FK2、FK3的多样性指数均有呈先下降后上升的趋势；进行实验室贮存后的大曲RG2、RG3的多样性指数均有上升的趋势，且比其他处理大曲的多样性高。因此，热风干燥工艺对实验室贮存期大曲的真菌群落多样性有一定促进影响。

表1 不同处理方式大曲真菌多样性指数Table 1 Diversity index of fungal communities from Daqu samples

2.3 不同处理大曲的群落组成结构

图3 大曲样品中真菌在门分级水平上的种类和相对丰度Fig. 3 Relative abundance of fungal communities at phylum level

根据物种注释结果，选取大曲在门分类水平上最大丰度排名靠前的物种，生成物种相对丰度柱形累加图，便于直观查看不同处理方式的大曲相对丰度较高的物种及其比例。由图3可见，在门的分级水平上，所有大曲中共检测出了子囊菌门（Ascomycota）和接合菌门（Zygomycota）2大门类，其相对丰度较高，占到相应样品总类群的99.9%以上，且在各处理后大曲中的含量不尽相同。子囊菌门在FK1和ZR1的丰度分别比RG1多11.2%、7.2%，说明在大曲干燥的过程子囊菌门的比例逐渐增加；大曲在贮存1、2个月后，子囊菌门类比例大小为ZR2＞FK2＞RG2和ZR3＞RG3＞FK3，可见在贮存期，自然干燥大曲有利于子囊菌门类生长，而热风干燥对其成长和繁殖存在阻碍作用。从大曲中接合菌门类相对丰度来看，接合菌门比例大小是RG1＞ZR1＞FK1，说明大曲干燥的过程接合菌门所占比例在逐渐较少，而热风干燥对其比例减少的可能性更大；大曲在贮存1、2个月后，接合菌门类在RG2和FK2中的相对丰度比ZR2大，在RG3和FK3中的丰度比ZR3的丰度大，说明热风干燥的大曲在贮存时期有利于接合菌门微生物的生长和繁殖。

构建基于GraPhlAn的大曲样本总体分类等级树，从复杂的群落数据中，快速发现优势微生物类群[17]。如图4所示为从门到属（从外圈到内圈依次排列）所有分类单元（以节点表示）的等级关系，节点大小对应于该分类单元的平均相对丰度。

图4 基于GraPhlAn的大曲样本总体分类等级树图Fig. 4 Overall classification based on GraPhlAn of Daqu samples

结果显示：所有大曲样品里，真菌微生物属水平上有4 种相对高丰度的微生物，平均相对丰度最高的是嗜热子囊菌属（Thermoascus），其次是根毛霉属（Rhizomucor）、曲霉菌属（Aspergillus），相对较低的是假丝酵母属（Candida）。

图5 大曲样品中真菌在属分级水平上的种类和相对丰度Fig. 5 Relative abundance of fungal communities at genus level

如图5所示，在属的分级水平上，共检测到19 种真菌类群，优势类群包括有：嗜热子囊菌属、嗜热霉菌属（Thermomyces）、根毛霉属、曲霉菌属、假丝酵母属，其相对丰度占全部真菌群落的92.3%以上，其中最优势菌属是嗜热子囊菌属，约占40.2%。

至今，嗜热子囊菌相关研究已较成熟。它能产生具有高热稳定性和活力的纤维素酶、蛋白酶等，特别是其所产的过氧化氢酶是迄今为止已报道过的热、碱稳定性最好的[18]。张婕等[19]从嗜热子囊菌原变种中克隆了一个几丁质酶同源基因，并在毕赤酵母中得到高效表达。嗜热子囊菌能降解糖类和蛋白质等并具有良好的热稳定性，有利于大曲产酒生香作用[20]。结果分析显示嗜热子囊菌属在大曲RG2、RG3中的相对丰度为31.2%、23.9%，相比于FK2和FK3，同比低了13.6%、20.5%，相对丰度下降明显，说明实验室贮存条件相比曲库贮存会一定程度地抑制嗜热子囊菌的生长；但在其他不同处理大曲中的生长稳定，基本恒定，且相对丰度比例较其他真菌微生物大，说明嗜热子囊菌在大曲真菌群落中具有较明显的优势，而要保持其的优势，需提供曲库的贮存条件。该结果为今后研究嗜热子囊菌在热风干燥大曲中的应用提供支持。

霉菌主要产糖化酶，被视为大曲糖化降解动力的主要来源[3,21]。近年有报道[22]分析了各酿造环境中曲霉的生态结构分布。与降温期大曲相比，曲霉菌在贮存期间表现出良好的生长态势，与已报道霉菌在贮存阶段活跃相一致[23]。曲霉菌在RG2、RG3中的相对丰度分别为25.5%、37.6%，相比于FK2、FK3，同比增加了11.2%、13%，随着贮存时间的延长，曲霉菌生长越旺盛。分析可能是实验室贮存环境里几乎没有曲虫的存在（除大曲自身所带曲虫外），而曲库中曲虫滋生，随贮存时间延长曲虫数量上升，曲虫能吃掉大曲，影响了曲霉菌类的生长，并使得曲块糖化力、液化力下降[24]。说明实验室的贮存环境相比于曲库更有利于曲霉菌的生长。

假丝酵母属是大曲发酵过程重要的真菌之一，主要产酒精和脂类物质[25]。在进行干燥排潮后的大曲，假丝酵母属在FK1、ZR1的相对丰度分别为22.3%、17.7%，均远大于在RG1中的丰度，表明当温度降到45℃左右时，酵母菌类活动明显，数量增加，说明干燥工艺后的环境更利于假丝酵母生长，与已报道降温期酵母的数量有所上升一致[26]；在贮存1、2个月后，其丰度大小为FK2＞FK3、ZR2＞ZR3，随贮存时间的延长而减少，可能是受到其他微生物竞争抑制的影响。

2.4 大曲真菌在属水平上的微生物组成热图

根据属水平上的物种注释及丰度信息，选取丰度排名靠前的真菌属及其在每个样品中的丰度信息，从物种和曲样两个层面进行聚类，绘制成热图。根据颜色梯度反映不同大曲的真菌群落相似差异性及物种聚类关系。不同处理的大曲真菌在属水平上的微生物组成热图如图6所示，反映了不同处理大曲样品的相同性和差异性。

图6 不同处理大曲真菌在属水平上的微生物组成热图Fig. 6 Heat map showing fungal composition from Daqu samples with different treatments

由图6上端的样本间聚类看出，所有样品大致分为4 组。大曲RG3根据丰度信息单独聚类为一大组；其他8 种大曲聚类为一大组，表明了8种大曲之间类似的群落结构，其中，ZR2的真菌群落独立为一组，大曲RG2和ZR3近似，FK1、FK3、RG1、ZR1、FK2聚类成一组。

另外，从图6左端物种聚类可以看出，根霉菌属（Rhizopus）、嗜热子囊菌属、根毛霉属在大曲RG1、ZR1中的比例很高。但相对于RG1，经过自然干燥后的大曲ZR1，柯达酵母属（Kodamaea）、生丝毕赤酵母属（Hyphopichia）、假丝酵母属的比例均有所增加，说明自然排潮降温，曲房中的湿度和温度的调节后，酵母群类微生物生长旺盛；但人为的热风干燥处理不利于大多数真菌微生物的生长，只有假丝酵母属的数量有所增加。从贮存方式来看，相比于大曲ZR1，大曲ZR2中的拟青霉属（Paecilomyces）、支顶孢属（Acremonium）增加明显；大曲ZR3中嗜热子囊菌属、Rasamsonia、生丝毕赤酵母属（Hyphopichia）成为优势菌群。值得注意的是，耐盐真菌（Wallemia）、丝衣霉菌属（Byssochlamys）、青霉菌属（Penicillium）、曲霉属是大曲RG3中的主要真菌群类，其比例也远大于其他大曲。

2.5 PCA结果

按干燥和贮存处理的不同，将9 个大曲样品分成3 个组，分别是RG1、FK1和ZR1为组A，RG2、FK2和ZR2为组B，RG3、FK3和ZR3为组C。

图7 不同处理方式大曲中真菌微生物群落组成PCAFig. 7 Principal component analysis of fungal communities from Daqu samples with different treatments

由图7可以看出，运用PCA方法比较不同处理方式的大曲，可获得两个主成分，主成分1的贡献率为77.16%，主成分2的贡献率为12.04%，累计贡献率达到89.2%，因此主成分1和主成分2基本可以全面反映研究区域真菌微生物群落情况并将不同处理方式的大曲真菌群落区分开来。大曲样品RG1和ZR1聚集，FK1虽落点较远，但根据主成分1（贡献率达到77.16%）可以将FK1与RG1、FK1聚成一类，说明热风干燥工艺对大曲的真菌微生物群落有一定影响但影响较小；FK3、ZR3聚集，说明基于热风干燥工艺并返回曲库贮存这一处理方式的大曲与自然干燥自然贮存的大曲差异不明显；而RG3落点相对较远，说明热风干燥后经实验室贮存2 个月的大曲真菌群落有较大的变化。

3 结 论

通过灯光诱捕、使用药剂等处理大曲制作环境，治理效果显著[27-29]，其中外源热风干燥工艺可以完全杀灭曲虫，考虑到此工艺以及曲块在不同贮存环境（是否避开存在曲虫的曲房贮存）可能会对大曲中真菌群落产生影响，因此本研究对不同处理方式的大曲的真菌群落进行了探索。采用荧光定量PCR和Illumina MiSeq高通量测序技术，研究排潮降温期大曲通过热风、自然干燥处理，对比实验室贮存、曲库贮存9种不同处理方式的大曲在真菌群落之间的差异。

结果发现不同处理方式大曲中的真菌18S rRNA基因拷贝数在1×1011～4.5×1011copies/g之间；ZR3拷贝数最大为4.5×1011copies/g。基于大曲的真菌多样性指数分析，大曲RG2、RG3、ZR3的多样性较高。属水平上相对丰度的解析中，不同处理大曲的优势真菌类群均为嗜热子囊菌属、根毛霉属、曲霉菌属、假丝酵母属。其中嗜热子囊菌属在大曲真菌群落中具有明显的优势，若要保持其优势，需提供曲库的贮存条件；而实验室贮存环境相比于曲库更有利于曲霉菌属类的生长；干燥工艺后的环境更利于假丝酵母属类生长。

PCA可看出基于热风干燥工艺并返回曲库贮存这一处理方式的大曲与自然干燥自然贮存的大曲差异不明显；而大曲RG3落点相对较远，再结合微生物组成热图可分析大曲RG3中耐盐真菌、丝衣霉菌属、青霉菌属、曲霉属在大曲RG3中的比例远大于其他大曲，是大曲RG3区别于其他大曲的主要真菌群类，说明热风干燥工艺以及热风干燥后经过2 个月实验室贮存的大曲中真菌群落有较大的变化，差异性明显，故此类大曲有进一步研究的价值，为后续研究提供参考。