幽门螺杆菌感染临床检测方法及应用进展*

文婷婷,陈亚芳△,戴 娜,沈正林,王建军,杨 勇,王 婷

1.江苏大学附属昆山医院药物临床试验机构办公室(昆山215300)，2. 江苏大学附属昆山医院消化内科(昆山215300)，3. 江苏大学附属昆山医院检验科(昆山215300)，4．江苏大学研究生院外科学(镇江 212013)，5. 江苏大学附属昆山医院门诊药房(昆山215300)

主题词 幽门螺杆菌 细菌感染/诊断

自1994年世界卫生组织国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)定为Ⅰ类致癌原以来[1]，HP的研究一直备受关注。HP与多种消化道疾病有关，例如慢性胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡、非溃疡性消化不良、胃癌及胃黏膜相关性淋巴瘤等，甚至胃肠外疾病[2]。HP感染的临床检测方法主要分为侵入性与非侵入性两种。侵入性检测有一定创伤性，凝血功能差、服用抗凝药物的患者或者患儿依从性较差；而非侵入性检测方法创伤性较小，弥补了侵入性检测依从性差的不足[3-5]。本文对现有的HP感染临床检测方法进行系统性总结，比较临床应用中各方法的优势与缺点。

1 侵入性HP感染检测方法

侵入性HP检测方法均需事先进行胃镜下活检，取样后进行后续分析。主要有下列几种：

1.1 分离培养及涂片 原理：将活检标本取材后送检验室制匀浆，然后使用固体或液体培养基划线培养。培养基中加入1 %～10 %动物血清及选择抗生素(万古霉素或多粘菌素等)，在微需氧(5%O2)37℃条件下培养3～5d，需要时，可延长至1～2周。制片形态为革兰染色阴性、S状弯曲或短杆菌，暗视野或相差显微镜下有典型钻探样运动。此法被认为是金标准，是HP感染的确切证据。但该方法费时、费力、周期长。

1.2 组织学染色和组化染色 使用常规病理切片进行染色。在油镜下HP呈典型的S状或海鸥状弯曲，位于粘膜层表面或侵入胃腺窝部或在上皮细胞连接处。根据部位与染色，而与一般杂菌鉴别开。此法为HP诊断的金标准之一。

1.3 快速尿素酶试验法(RUT) 原理 HP为人胃内唯一产生大量尿素酶的细菌，因此可通过检测尿素酶来诊断HP感染。取病变处黏膜胃窦黏膜组织1块，利用快速尿素酶诊断试剂盒进行检测。将黏膜组织加入含有酚红的尿素酶试剂之中，于10 ～30 ℃下静置5 min后观察最终结果。判断标准：最终颜色为黄色则视为阴性，为玫瑰色或者浅红色则视为阳性[6]。

2 非侵入性HP感染检测方法

非侵入性HP检测方法无需做胃镜检查，更易被老年人、儿童所接受。主要有下列几种：

2.113C-尿素呼气试验(13C-UBT) 检测原理：患者口服含有13C同位素标记的尿素，通过HP代谢产生的尿素酶将其分解，并产生13CO2。根据患者呼出气体的13C含量，判断受试者是否感染HP[2]。临床上常将此法作为诊断“金标准”。结果多以DOB表示。

2.214C-尿素呼气试验(14C-UBT) 检测原理：与13C-UBT类似，借助HP代谢尿素酶分解尿素为CO2与氨的特性，给患者服用14C-尿素胶囊，患者呼气过程中有14C标记的14CO2排出，通过检测是否存在14CO2，即可确定HP存在与否[7]。

2.315N-尿氨排出试验(15N-UDT) 检测原理：依据HP代谢尿素酶的特性，15N标记的尿素经过尿素酶代谢产生15N标记NH3，然后经过肝脏、肾脏代谢为尿液排出体外。通过尿液收集，即可知是否感染HP[8-9]。受代谢途径的限制，严重肝肾损伤的患者不宜使用。

2.4 胶体金法 此法常用于检测口腔中HP感染——唾液HP抗原检测法(HPS)[10]。原理：唾液中的HP代谢生成的尿素酶可与胶体金标志物结合，而胶体金移动至特定区域又与相应的抗体发生特异性结合，聚集在检测带上，可直观目测到显色结果。尽管HPS是否作为口腔HP感染首选检测手段尚未经过验证，但胶体金法操作简便，灵敏度、准确性和特异性较高，结果直观易得，有广泛应用前景。

2.5 分子生物学技术 采用分子生物学手段进行分子层面的改造，获得所需要的产物并进行分析。主要有以下几种：

2.5.1 PCR技术：定向扩增HP特异功能基因(如尿素酶A、B结构亚单位等)或结构基因，设计专用引物，在一定条件下进行PCR 反应，然后将产物进行探针杂交等特异性检测[11]。实时荧光定量PCR(FQ-PCR)包括Taqman探针法和SYBR Green荧光染料掺入法。和一般PCR相比，能够对细菌核酸进行定量检测，但其开展需要昂贵的热循环仪，限制了在临床上的应用[12]。PCR拥有超过95%的特异性与敏感性，适用于检测消化道出血的患者。此外，PCR具有检测快速、需要原始菌量少的特点，可作为临床上重要的辅助检测手段。

2.5.2 ELISA技术：原理：使用特定酶标记抗原或抗体，与待测物反应形成抗原-抗体复合物，然后显色。是一种操作简单、廉价的非侵入性诊断HP感染的方法，常见的检验样本有血清、粪便、唾液等[13-14]。但往往存在不能区分是否为现时还是既往感染的缺点，多被用于流行病学与回顾性研究。其中，粪便HP抗原检测(HPSAT)应用较广泛，在大规模筛查HP感染和根除HP后随访中具有重要价值[15]。

2.5.3 环介导恒温核酸扩增技术(LAMP)：该技术是一种新型核酸扩增技术，可以在等温条件下，短时间内进行核酸的扩增[5,16]。与常规PCR相比，操作简单，兼具高特异性与灵敏度，对仪器的要求较低，结果可通过肉眼直观判断。适合用于临床快速诊断HP是否感染。

2.5.4 活细胞原位荧光杂交技术(FIVH)：该技术以原位杂交荧光技术(FISH)为基础，建立的新型检测方法。制备荧光标记的核苷酸探针，与相应靶细胞中的DNA或RNA分子杂交，通过观察荧光信号，可判断靶细胞中细胞器的形态与分布。具有反应时间短、易操作的特点，敏感性与特异性也可达到分析需求[17]。

2.5.5 蛋白芯片法： 同时检测多种HP的相关抗体，如Ure、CagA、VacA等，操作简便，价格低廉，可实现高通量检测[18]。其中，Ure、CagA抗体阳性对诊断HP感染有较高的临床价值。本法适用于流行病学调查研究，通过分析感染者相关抗体的分型，可以预测HP的感染。本法对于HP感染的诊断具有较高应用前景。

3 各种HP检测方法的比较

近几年主要的HP检测方法研究状况见表1。

表1 近几年主要的HP检测方法研究状况

细菌培养是诊断HP感染最可靠的方法，其特异性可达到100%[23]，为临床公认的“金标准”。影响此法准确性的因素包括：样本取材大小、数量与部位、染色方法、抗生素与质子泵抑制剂的使用、临床医师经验等[24]。由于此法在微需氧且无菌环境下进行3～5 d恒温培养，对检验技术的要求高，耗时过长，难以满足常规检验的需求。而且患者需事先进行纤维胃镜，对于凝血功能较差、儿童与老年人来说并不适合，种种因素限制了其在临床的应用。

RUT法因试剂廉价、反应速度快、操作方便等优点广泛应用于临床，在胃镜检查时被列为首选。但该方法不可避免地受到环境温度、反应时间、细菌密度及药物的影响，取材也受HP 在胃“灶性分布”的影响，其敏感性和特异性低。HP产生的尿素酶同为其定值所必需。尿素酶的同工酶有内、外尿素酶两种，内尿素酶具有维持HP稳定的作用。胃内pH上升会导致内尿素酶活性降低，从而导致假阳性的产生[25]。综合上述原因，RUT检测时出现假阳性/阴性次数较多，需要进一步的检测来确证HP感染。

13C-UBT与14C-UBT均为非侵入性检测，因为易操作，无创，检测快速的优点而广为各年龄段的患者所接受。二者也被国内外专家推荐作为临床HP感染诊断的“金标准”。因为13C为自然界天然存在的同位素，而14C具有微弱的放射性，所以对于孕妇、儿童、年老体弱的人群更适合做13C-UBT，在条件允许的情况下可以在短时间内多次检查。影响UBT准确性的因素亦有很多，重要的因素包括试餐中是否包含柠檬酸、气体收集时间、临界值设定等。由于UBT需依赖尿素酶的存在而间接测定HP，而尿素酶并非HP所特有。故尽管进行了UBT，试验的结果仍需进一步验证来确定。15N-UDT同样具有UBT的各种优势，15N标记尿素无放射性，对人体并无损害，但15NH3需在肝脏中代谢，经过肾脏排出，有严重肝肾损伤者不宜使用。况且质谱仪造价昂贵，标本采集时效性差也限制了其推广[26]。

ELISA法操作简单、耗费较低、特异性与敏感性较高。其中，血清抗体检测法通过HP抗体的检测来诊断HP是否感染。临床常见的被检测抗体主要有HP抗体(抗-HPIgG)与CagA毒素抗体(抗-HPCagA)。HP抗体阳性表示的是感染过HP，而CagA毒素抗体阳性是指有毒素产生的HP菌株感染。血清抗体检测法的准确性依赖于试剂的抗原选择。由于不同地区HP菌株抗原性差异，应选择当地流行菌株或不同组菌株汇总抗原谱，以提高检测的准确性[11]。由于此法不能区分是既往感染还是实时感染，常被用于大面积流行病学研究与回顾性研究。临床并不常用此法诊断，且不能作为HP是否根除的随访依据。但是此法不受铋剂、抗生素、PPI、H2受体拮抗剂的影响，而且人体不会接触放射性14C元素，适合人群更广，相较于UBT而言更有优势[27]。HPSAT法检测原理为：HP感染者体内，HP代谢产物与死亡菌体的崩解产物会随着胃粘膜更新脱落到消化道内，这些抗原可抵御消化酶类的降解并随粪便排出。使用酶标双抗体夹心法测定粪便中HP抗原，可间接反映是否感染HP。HPSAT准确性受粪便性状、药物应用与检测时间影响。腹泻患者由于粪便中抗原浓度较低，易出现假阴性结果；上消化道出血排出黑便的患者，由于交叉反应易产生假阳性结果[15]。

PCR法检测HP的常见毒力基因有16S rRNA、ureA、cagA、cagL、vacA等[28]。与其他检测手段相比，此法对消化道出血的患者同样适用[11]。PCR方法无需经过细菌培养、检测快速、操作简便。而且，此法也可以检测特定位点耐药基因的突变。Talarico等[29]建立了一种新型的实时PCR方法用于检测HP克拉霉素耐药基因23S rRNA的突变。这种方法可以检测野生型合并耐药等位基因的混合感染，前提是等位基因占据不超过10%的23S rRNA基因拷贝数。LAMP为一种新型核酸扩增技术，检测快速，可作为胃镜检查的同步辅助检测手段。齐诗蕊等[5]使用LAMP法进行HP检测，选择80例胃液作为检测样本，其准确率为98.75%，灵敏度为97.06%，特异度为100%，与13C呼气试验结果无统计学差异(P>0.05)。可达到胃镜下同步、无创操作、降低患者出血风险的目的。与传统PCR法相比，LAMP为恒温扩增，反应时间比PCR短，对仪器要求低，可以实现视觉直观检测，而且灵敏度可达传统PCR的10倍。此法对临床实现高效检测HP有较大的应用价值。Bakhtiari等[30]选择26695 ureC基因作为模板进行引物设计，经过LAMP法扩增来检测HP。每次反应的灵敏度为10fg，检测限达到了6个DNA拷贝数。这意味着在HP的数量较低的情况下，此法仍然可以准确地检测出。

4 小 结

HP是胃内发现的感染率很高(我国大于50%)的细菌[31]，大多数胃肠道疾病都由其感染引发[32-33]。随着研究的深入，发现HP亦可能与代谢相关性疾病(糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等)的发生有关[34]。HP的准确检测是辅助临床治疗的前提。如今HP非侵入检测的灵敏度和准确度均可达到70%以上，而侵入性检测可达到100%。非侵入性检测相较于侵入性检测而言，具有无创、高效、价格低廉的优势，更易为大众所接受。新型的检测手段也正在逐步更新与完善中，如LAMP，FIVH等基因层面的检测，其均具有高准确性与灵敏度，且可以实现实时、直观检测。随着医学检测手段的不断进步，相信会有更多新技术应用于临床。