2型糖尿病患者C11orf 65基因rs11212617位点多态性与二甲双胍临床疗效相关性研究*

钟春元，陈祚和，邱成旭，杨守东

1.江西省兴国县人民医院(兴国 342400)，2.内蒙古包钢医院药剂科(包头014010)

主题词 @C11orf 65基因 糖尿病，2型/免疫学 二甲双胍 多态现象，遗传学

我国的患者人群中，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成为威胁人民健康的重大慢性病，二甲双胍在2型糖尿病的治疗中具有举足轻重的地位，它不但能够增强机体对胰岛素的敏感性，而且能够降低肝糖原的分解、增强肝脏对葡萄糖的吸收，是目前在全世界的口服降糖药物当中应用最广泛的[1]。但是，即便在患者依从性良好的情况下，临床中也能观测到降糖疗效存在着较大的个体差异。有研究发现，在规范使用二甲双胍的患者中，约有30%的患者降糖患者并不理想[2]。有文献报道C11orf 65基因多态性与二甲双胍的降糖效果具有显著的相关性[3-4]，但上述研究均在白种患者人群中展开，未在中国人群中得到相关验证。因此，本研究旨在探索就诊于我院的T2DM患者中，其C11orf 65基因rs11212617位点的多态性与二甲双胍的临床降糖效果之间的相关性，为临床中二甲双胍的使用提供借鉴。

资料与方法

1 一般资料 选择2015年1月至2017年12月就诊于我院的新发T2DM患者，纳入标准依据1999年WHO糖尿病诊断标准诊断为T2DM，要求纳组的T2DM患者接受二甲双胍的单药治疗，而且要保证在后来的12个月内接受临床的随访要求。最终入组180例患者，其中男性100例，女性80例，平均年龄(61.2±9.2)岁，患者的个体之间无任何亲缘关系。排除标准如下：1型糖尿病患者除外；遗传性糖尿病患者除外；已经出现了糖尿病的并发症患者除外；患有心脑血管疾病的患者除外；肝肾功能异常的患者除外；正在服用除二甲双胍外的其它降糖药物(中药或其它降糖机制的化学药物)的患者要剔除；在使用二甲双胍的过程中，如果患者出现了严重的不良反应或药物过敏，应从研究中剔除。纳入的所有患者或其家属均要签署知情同意书。

在患者服用二甲双胍之前以及12个月的随访结束的时候，对患者的糖化血红蛋白(HbA1c)水平进行检测，依据各患者的HbA1c水平变化幅度，评价不同C11orf 65基因型的患者二甲双胍的降糖疗效。

2 血样收集与DNA的提取 患者的基因型不会改变，在任意时间均可采集外周血，采血量约于2ml，置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，离心分离血浆及血细胞。采用市售试剂盒提取基因组DNA(胍盐酸法)，置于-20℃冰箱中备用。

3 引物、PCR扩增及基因分型 采用聚合酶链扩增反应-限制性长度片段多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术分析C11orf 65(rs11212617 C>A)的基因型，上下游引物分别如下：

上游引物：5’-TCCGAGTTTGGCCCTAGCGTCG-3’；

下游引物：5’-GACCATGGACAGCCACACTGAA-3’。

采用Amp 9700 PCR系统(Applied Biosystems, Foster city, CA, USA，Perkin Elmer基因)对扩增过程进行控制。PCR的扩增条件：95℃ 进行10 min的预变性，95℃进行30s的变性， 58℃进行30s的退火，72℃进行30s的延伸，共进行30个循环，最后72℃下10 min结束本反应。PCR的产物采用限制性的内切酶Taq I (New England Biolabs, Massachusetts, USA)进行酶切。212bp的扩增子酶切以后可得到26bp和186bp片段的，即为位点rs11212617的CC基因型，AA基因型能够保持在212bp，扩增子经酶切后会得到26bp、186bp与212bp三个片段的则为杂合基因型CA，根据条带长短与数量确定患者最终的基因分型。为了验证本方法的准确性，我们随机选取了样本采用直接测序的方法进行验证，最终基因分型的成功率是>98.9%的，对重复样本的基因分型结果中没有发现错误的情况。

结 果

1 C11orf 65基因的多态性分布频率 入组的T2DM患者中C11orf 65 rs11212617等位基因频率为65.0%。C11orf 65 rs11212617基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P=0.16)，这表明了本研究人群C11orf 65 rs11212617基因型分布符合遗传平衡，入组的患者人群具有很好的代表性。见表1。

表1 T2DM患者中C11orf 65 rs11212617各基因型频率[例(%)]

2 C11orf 65 rs11212617对二甲双胍降糖疗效的影响 根据C11orf 65 rs11212617不同的基因型(CC、CA、AA)将180例入组患者分为CC型、AA型和AA型三个组别。三种不同基因型携带者单用二甲双胍后HbA1c变化情况有统计学差异。携带C11orf 65 CC基因型患者接受二甲双胍单药治疗12个月以后，HbA1c的下降幅度是(2.69±1.00)%，与AA基因型患者(0.99±0.69)%(P<0.001)和CA基因型患者(1.42±1.22)%比较具有统计学差异(P<0.001)。

3 不同基因型的分组结果比较 A位点若为纯合突变时，HbA1c的下降幅度最小，CA基因型与CC基因型患者之间的HbA1c下降差异也存在统计学的意义(P=0.00246)。单药治疗12个月以后，CC、CA和AA这三种基因型的患者HbA1c水平变化见表2。二甲双胍临床降糖疗效与C11orf 65不同基因型之间的相关性分析见表3。

表2 C11orf 65 rs11212617基因多态性与二甲双胍单药疗效的相关性分析(n=180)

注：12月HbA1c 代表治疗并随访12个月后测量的指标；△表示指标经12个月治疗后的变化程度

表3 C11orf 65 rs11212617不同基因型与二甲双胍临床疗效的相关性分析

讨 论

除着我国经济的发展与人民生活水平的提高，近年来糖尿病已经严重威胁到了我国居民的健康水平，且糖尿病的患病率也显著的增加，自1980到2013年间，患病率已经从0.67%上升到了10.4%。最常见的便为T2DM[5]。在T2DM的治疗当中，口服降糖药物治疗是最主要的治疗方法。随着药品的研发，降糖药物的种类亦在增加，已经从最开始的双胍类和磺脲类降糖药，开发出了多种新型的降糖药物，如胰岛素的增敏剂、α-糖苷酶的抑制剂、二肽基肽酶-4(DPP-4)的抑制剂、GLP-1类似物等不同类型的药物。但是二甲双胍依然是单药治疗中的首选，得到了2017年中国T2DM防治指南的推荐，即使是在多次注射胰岛素时，对于肥胖的糖尿病患者也可以加用二甲双胍治疗[5]。当前，国内外的处方中二甲双胍在仍占有很大比例。

但是，二甲双胍的临床疗效在不同的患者间却存在着较大的差异。二甲双胍有一定的亲水性，口服后迅速吸收进入血液，并以原型的形式通过肾脏从尿液当中排出来[6]，二甲双胍在人体的药物动力学和药效动力学过程当中有多个不同类型的蛋白直接参与，这些蛋白可能会影响到药物的吸收、分布以及排泄过程。C11orf 65为11号染色体开放阅读框65的英文简写(Chromosome 11 open reading frame 65)，这是一个蛋白编码基因，已知对T细胞造血干细胞白血病相关。目前国际上仅有三篇文章报道了该基因的位点变异与二甲双胍的临床疗效相关[3]，本研究以中国人群为研究对象，考察该基因的变异对糖尿病患者接受二甲双胍单药治疗后的HbA1c下降水平，研究结果与国外报道相近，即C11orf 65基因位点发生变异的患者其对二甲双胍的反应性降低，而野生型患者的临床效果较好。

诚然，二甲双胍的降糖疗效不仅受单基因的影响，而是受到了多基因的调控，除了本研究检测的C11orf 65外，还有其它基因的研究报道。众所周知，启动子是调整基因表达的重要因子，已有报道发现MATE1基因的启动子区g.-66T>C变异致使启动子的活性降低，最终影响了二甲双胍的降糖疗效[6]。此外，OCT(Solute carrier family,SLC22)家族中的OCT1与OCT2(一种转运蛋白)，分别分布在上皮细胞和肾近端小管基底外侧膜中，能够介导药物摄入到肝脏和肾小管的上皮细胞[7]，也会影响二甲双胍的临床降糖效果。ATM基因是一个与DNA修复有关的重要基因，它的基因变异也可能会影响到二甲双胍的降糖效果，但目前各项研究仍未得到一致的结论，还需要进一步的深入探索[8]。

综上所述，C11orf 65基因rs11212617 AA基因型与CA和CC基因型HbA1c在治疗前后变化差异具有统计学的意义(P<0.01)。事先对C11orf 65基因rs11212617位点的多态性进行检测，能够帮助我们预判二甲双胍降糖疗效，对临床的安全有效用药具有一定的参考价值。