沙漠嘎HPLC特征图谱研究△

刘湉，马群，王志鑫，高艳艳，姜悦，陈国超，李双双，杨飞，乔延江

(北京中医药大学 中药学院，北京 102488)

沙漠嘎为菊科植物差不嘎蒿ArtemisiahalodendronTurcz.的嫩枝叶，首载于《中国沙漠地区药用植物》，广泛分布于我国西北、东北地区的沙漠中，在防风固沙方面发挥十分重要的作用[1-2]。沙漠嘎味辛性温，具有止咳、祛痰、平喘、解表祛湿功能，可用于治疗慢性气管炎、哮喘、感冒、斑疹伤寒及风湿性关节炎等症[1]，课题组前期研究表明沙漠嘎具有较好的抗炎平喘作用[3-5]，但目前沙漠嘎药材尚缺乏规范的质量标准。中药特征图谱具有整体性与模糊性两大特点，能全面反映中药材的质量[6]，因此本研究采用高效液相色谱法建立沙漠嘎的对照特征图谱，为该药的相关研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(配置有G1311B四元泵，G1316A柱温箱，G1315D DAD VL型二极管阵列检测器)(美国安捷伦公司)；KH-250型速控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；电子天平BS-124S(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；ZDHW型可调式电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.2 材料

甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯(美国赛默飞世尔科技有限公司)；娃哈哈饮用纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。对照品：李属素(批号：B30213，纯度≥98%，购于上海源叶生物科技有限公司)，甲基-3-(4′-羟苯基)香豆酸(自制，纯度≥92%)、圣草酚-7-甲醚(由贵阳中医学院提供，纯度≥98%)、茵陈蒿香豆酸A(自制，纯度≥98%)、异樱花亭(批号YY95027，纯度≥98%，购于上海源叶生物科技有限公司)。实验用11批次沙漠嘎药材于2014年7月至2017年7月采收于内蒙古自治区通辽市与赤峰市，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为差不嘎蒿ArtemisiahalodendronTurcz.的嫩枝叶，药材具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相及洗脱条件：采用等度洗脱，0～122 min，乙腈-0.1%甲酸溶液(30∶70)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：288 nm；进样量：10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取各批次沙漠嘎地上部分粉末2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定其质量，浸泡1 h，超声处理30 min，放冷，再称定其质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取李属素、甲基-3-(4′-羟苯基)香豆酸、圣草酚-7-甲醚、茵陈蒿香豆酸A、异樱花亭对照品适量，加甲醇制成每1 mL含李属素160 μg、圣草酚-7-甲醚250 μg、甲基 3-(4′-羟苯基)香豆酸200 μg、茵陈蒿香豆酸A 25 μg、异樱花亭260 μg的溶液，为混合对照品溶液。

3 方法学验证

3.1 精密度试验

精密吸取同一批次(S7)沙漠嘎地上部分样品溶液，重复进样6次，记录色谱图。以6(S)号峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，相对保留时间RSD在0.07%～0.54%，相对峰面积RSD在0.09%～4.11%，表明仪器精密度较好。

3.2 稳定性试验

精密吸取同一沙漠嘎地上部分样品溶液(S7)，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样，以6(S)号峰为参照峰，计算相对值，相对保留时间RSD在0.22%～0.72%，相对峰面积RSD在0.14%～3.65%，表明供试品在24 h 内稳定。

3.3 重复性试验

取同一沙漠嘎地上部分样品6份，各精密称定2.0 g，按2.1项下处理得供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，以6(S)号峰作为参照峰，计算相对值，结果各主要共有峰相对保留时间的RSD小于0.19%～0.67%，相对峰面积的RSD在0.20%～5.07%，表明重复性较好。

表1 沙漠嘎样品信息

4 结果

4.1 沙漠嘎地上部分HPLC特征图谱的建立

取沙漠嘎地上部分粉末(过筛)11批，按2.1色谱条件进行检测，采用“中药指纹图谱相似度评价系统2004 A 版”软件进行分析。自动匹配后生成对照特征图谱(见图1)。以对照特征图谱为标准图谱，分析S1～S11样品相似度分别为0.978、0.944、0.885、0.971、0.973、0.974、0.781、0.949、0.963、0.980、0.868。

4.2 特征图谱共有峰的确定

11批次沙漠嘎药材特征图谱见图2，共含有8个共有特征峰，其中6号峰保留时间适中，峰面积较大且稳定，峰形较好，故以6号峰(圣草酚-7-甲醚)为参照峰，11批次沙漠嘎共有峰的相对保留时间见表2，相对保留时间RSD在0.22%～2.18%，符合规定。

4.3 沙漠嘎HPLC特征图谱中特征峰的指认

精密吸取混合对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，所得HPLC图与已建立的 HPLC对照特征图谱进行比对，指认特征峰，结果3号峰为李属素、4号峰为甲基3-(4′-羟苯基)香豆酸、6号峰为圣草酚-7-甲醚、7号峰为茵陈蒿香豆酸A、8号峰为异樱花亭，见图1。

注：3.李属素；4.甲基3-(4′-羟苯基)香豆酸；6.圣草酚-7-甲醚；7.茵陈蒿香豆酸A；8.异樱花亭。图1 沙漠嘎HPLC特征图谱中特征峰的指认

图2 11 批沙漠嘎药材PHLC特征图谱的叠加图

5 讨论

5.1 检测波长的选择

本研究中考察了210、270、288 nm下的供试品溶液色谱图(见图3)，以色谱图中各色谱峰的分离度、数量、分布情况为考察指标，结果在210 nm下色谱峰较小；而在270 nm下色谱峰太少，288 nm下色谱图中色谱峰的数量适中，且沙漠嘎中的大部分黄酮类成分在288 mm处均有吸收[7]，故选择288 nm为检测波长。

表2 沙漠嘎共有峰相对保留时间(以圣草酚-7-甲醚为参照)

图3 沙漠嘎检测波长的选择

5.2 色谱柱的选择

由于沙漠嘎成分复杂，色谱峰分离难度较大，在HPLC特征图谱建立过程中对Agilent Extend-C18、Agilent Eclipse Plus C18两种类别的色谱柱进行了考察(见图4)，发现使用不同色谱柱所得结果会有明显差异，其中，Agilent Eclipse Plus C18系列色谱柱虽分离时间较另一种色谱柱稍长，但分离效果最好，同时重现性较好，故选择该色谱柱用于沙漠嘎HPLC特征图谱研究。

图4 沙漠嘎含量测定的色谱柱选择

6 结论

本研究建立的HPLC特征图谱能够较为全面地反映沙漠嘎所含化学成分信息，可为沙漠嘎的质量评价与资源开发利用提供参考。比较不同批次的沙漠嘎药材HPLC特征图谱，发现虽整体差异不大，但不同产地或批次药材所含特征成分的含量仍存在一定差异，其中S3、S7、S11的相似度较其他批次药材略低，推测沙漠嘎药材的质量存在地域差异，而不同产地气候、环境及土壤条件等因素的差异很可能是导致该地域差异的主要原因[8]。