肿节风黑斑病拮抗真菌zjts7的抑菌作用测定与鉴定△

宋利沙，蒋妮，2*

(1.广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023；2.广西大学农学院，广西 南宁 530004)

肿节风为金粟兰科草珊瑚属多年生草本植物草珊瑚Sarcandraglabra(Thunb.)的干燥全草，又名九节茶、接骨木等，主要分布于我国华南、华东、西南各省区，在朝鲜、日本、东南亚和印度也有分布[1]。其具有清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效，用于治疗血热紫斑、紫癜，风湿痹痛，跌打损伤等症，是中国药典的收录品种[2]，还是广西重要的传统瑶药品种“七十二风”中重要的风药品种之一[3]。现代药理和毒理研究表明肿节风还具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗肿瘤和促进骨折愈合及镇痛等多种活性，急性毒性试验结果属实际无毒，具有较好的安全性[4]。以肿节风为主要原料的制剂有草珊瑚含片、肿节风片、肿节风注射液、血康口服液等[5]。肿节风在广西靖西、融安、东兰等县大面积种植过程中，发生了一种严重影响生长的叶部病害(黑斑病)，此病害是由半知菌类炭疽属黑线炭疽菌Colletotrichumdematiu引起的[6]。经前期调查发现该病害平均发生率达50%以上，特别在融安的林下套种模式，发病率高达65%，严重影响了肿节风药材的生长及发展[6]，因此对肿节风病害的研究和防治具有重要意义。

目前，肿节风黑斑病的防治以施用化学农药为主，长期施用农药病原菌易产生抗药性和耐药性，难以根治，且易给生态环境带来农药残留等负面影响。利用生防菌防治植物病害，具有对环境安全的优点，已经成为防治植物病害的重要方法之一，是目前国内外研究热点，也是绿色中药材发展的必然趋势。至今，利用生防菌防治农作物病害的已有较多报道，而用于防治肿节风黑斑病的生防菌筛选和应用尚未见报道，作者在前期工作中从健康肿节风根系土壤里初步分离筛选到一株对肿节风黑斑病菌具有抑菌作用的真菌zjts7，本研究进一步测试对肿节风的黑斑病菌的抑制作用，并通过形态学和分子生物学特征对该菌株进行鉴定，以期为肿节风黑斑病菌的生物防治提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试病原菌：肿节风黑斑病菌菌株由广西药用植物园植病研究室分离和保存。2017年4月在广西壮族自治区药用植物园科研基地采集自健康肿节风根系土壤，备用。

1.2 拮抗真菌的分离

采用平板稀释法[7]进行健康肿节风根系土壤进行分离。

1.3 拮抗真菌zjts7抑菌作用测定

通过平板对峙[8]培养，在28 ℃下培养拮抗真菌和病原真菌5～7 d后，分别取直径5 mm的菌丝块接种于PDA培养基平板中，2个接种点在同一条中轴线上，且相距6 cm，以只接种病原真的平板为对照，重复3次。接种4 d后测其抑菌宽度，计算其抑菌率[9]。挑取拮抗真菌和病原真菌对峙培养相交处的菌丝，在光学显微镜下，观察并记录拮抗真菌zjts7对病原真菌菌丝形态的影响。

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1.4 拮抗真菌zjts7的鉴定

1.3.1 形态鉴定 拮抗真菌zjts7在PDA平板上培养5～7 d，观察在显微镜下的分生孢子、分生孢子梗及菌丝体等的形态特征，对其形态学鉴定。

1.3.2 ITS rDNA序列分析和比对 将培养3 d的拮抗菌株接种到40 mL PDA培养液的三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r·min-1，恒温振荡培养48 h后制成菌体悬浮液，离心收集菌体，采用改良的SDS裂解法用DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取真菌基因组DNA。ITS扩增引物序列为通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。扩增反应在25 μL反应体系中进行，Template(基因组DNA 20～50 ng·μL-1)为0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)为2.5 μL，dNTP(各2.5 mM)为1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加双蒸H2O至25 μL。热循环反应程序设置如下：94 ℃下初始变性4 min，接下来为94 ℃下变性45 sec，55 ℃下引物退火45 sec，72 ℃下延伸60 sec，30个循环结束后在72 ℃下修复延伸10 min。扩增中利用双蒸水代替DNA模板为空白对照。用凝胶电泳法检测PCR反应结果，吸取4 μL PCR产物加入1%(W/V)琼脂糖凝胶，凝胶置于1×TBE缓冲液(0.9 M Tris-Borate，0.01M EDTA，pH=8.3)中，在110 V下电泳40 min。将扩增后的 DNA 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化测序。并且把测序结果与GenBank中的序列进行blast比对。以ITS相似序列，利用MEGA4.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 拮抗真菌zjts7的抑制作用

经平板对峙培养，结果表明，拮抗真菌zjts7菌株对肿节风黑斑病菌菌丝具有较明显的抑制作用，抑制率可达到81.82%～100%(图1)。试验中观察发现，此木霉菌生长速度快，很快占领整个生长空间，对峙4 d后将病原真菌包围，抑制病原菌生长(图1-A-B)。挑取拮抗真菌和病原真菌交界处的菌丝，在显微镜下观察发现，肿节风黑斑病菌丝断裂、畸形、膨大(图2)。

注：A.四天后的黑斑病菌；B.对照；C.三天后的黑斑病菌；D.对照。图1 zjts7菌株对肿节风黑斑病生长抑制效果

注：a.对照；b.黑斑病菌菌丝膨大、畸形、断裂。图2 zjts7菌株处理后肿节风病原菌菌丝形态

注：a.菌落；b.分生孢子。图3 zjts7菌株形态

2.2 拮抗真菌zjts7的鉴定

2.2.1 形态鉴定 菌落初生长为白色，培养2 d后变绿，分生孢子浓密，均无色素和气味，暗绿色，菌落背面是绿色(图3-a)。分生孢子卵圆形或球形，大小为(3～5)μm×(2～4)μm(图3-b)。主分支呈树状，分生孢子梗呈对生，且无延伸丝；顶端具有短的瓶梗，且基部细，中间膨大。此菌株的形态特征和已报道的棘孢木霉T.asperellum菌株相似[10-11]。

2.2.2 拮抗真菌zjts7的ITS rDNA序列分析 以ITS1、ITS4通用引物对zjts7菌株进行PCR扩增测序。结果获得579 bp的rDNA-ITS基因序列，以blast程序将菌株的序列与GenBank中核酸序列进行相似性分析，此菌株rDNA-ITS基因序列与多个棘孢木霉T.asperellum的序列同源性最高，并构建其系统发育树，菌株zjts7与棘孢木霉T.asperellum在同一分支，相似性达到100%。

根据菌株zjts7ITS rDNA序列分析，结合形态特征，将其鉴定为棘孢木霉T.asperellum。

图4 以ITS序列构建zjts7菌株系统发育树

3 结论与讨论

肿节风黑斑病在南宁全年均有发生，随着温度的升高及降水的的增加，病害发生严重，防治困难，生产上依然以化学药剂防治为主。目前关于肿节风的黑斑病菌的生物防治研究尚未见报道。本研究以广西发生严重的肿节风黑斑病菌C.dematiu为靶标从健康肿节风植株的根系土壤种筛选出一株抑菌作用较强的真菌zjts7，并通过形态学和分子生物学特征将该生防真菌鉴定为棘孢木霉T.asperellum，且此真菌可造成肿节风黑斑病菌的菌丝膨大、畸形和断裂。

棘孢木霉T.asperellum具有抑菌防病促生等功能，对多种植物病原菌具有拮抗作用。如抑制芋头根腐病菌Pythiummyriotylum[12]、人参黑斑菌[13]、 可可黑荚病菌[14]、辣椒疫霉菌[15]、人参锈腐菌[16]、玉米大斑病菌Exserohilumturcicum[10]、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani[17-19]、核盘菌Sclerotiniasclerotiorum[10]、菠萝黑腐病菌Thielaviopsisparadoxa[20]、镰刀菌Fusariumsp.及腐霉菌Pythiumuhtimumsp.[10]等。杨帅等[20]研究出棘孢木霉发酵液降低番茄早疫病菌抗氧化防御酶的活力和GSH含量，增加了MDA的含量，同时其电导率显著升高，从而抑制番茄早疫病菌的生长发育。覃柳燕等人研究出棘孢木霉PZ6菌株可在一定程度上提高香蕉苗对枯萎病菌的防御能力，提前施用PZ6菌株可有效阻止病原菌FOC4侵入香蕉苗，延缓植株发病[21]。棘孢木霉还能促进黄瓜幼苗生长[11]，诱导番茄抗灰霉病[18]。杨兴堂等人研究出棘孢木霉 ACCC30536 能够改善黄花蒿的光合能力，促进干物质的积累，从而提高其叶的产量[22]。姜传英等人研究出这3个棘孢木霉菌株均能有效提高山新杨的光合能力，促进其生长；并且，Ta536 菌株对山新杨幼苗的诱导效果最好[23]。贺字典等人研究出用荧光定量PCR方法检测土壤中棘孢木霉数量具有快速、灵敏度高、可靠性强等优点，可用于检测生防菌棘孢木霉施用后的定殖量和生防效果[24]。此外，棘孢木霉对玉米灰斑病菌Magnaportheoryzae具明显重寄生作用[10]。可见，棘孢木霉是一种具有较大潜力的生防真菌。本研究下一步工作，将对棘孢木霉zjts7菌株的抑菌机理，及其对肿节风病害的防治效果开展研究。