醋炙对元胡水煎液物理化学性质及抑制肿瘤细胞活性的影响△

王征，唐志书，梁艳妮，任浪浪，程静，宋忠兴

(陕西中医药大学 陕西省中药资源产业化协同创新中心/陕西省中药基础与新药研究重点实验室/陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西 咸阳 712046)

中药是一个复杂体系，一种中药中常含有多种结构、性质不尽相同的化学成分，这也是中药多靶点多效应的物质基础[1]。中药在炮制、煎煮的过程中，各种化学成分之间发生着复杂多变的各类物理、化学变化，从而使这一原本复杂的体系更加复杂。长期以来，学界往往以中药的某类或某几个化学成分作为中药质控的标准，而忽视了反映中药作为一个整体的物理化学性质的变化[2]。课题组经过长期研究发现，不同炮制方法、不同溶剂提取的中药，其自身物理化学性质存在很大区别[3-4]。中药自身的物理化学性质是中药中不同化学成分及结构组成的外在表现，具有便于检测、性质稳定、可重复性好等优点，与中药质量及其药效学具有密切的联系[5]。故此，探索中药自身的物理化学参数与中药质量和药效学之间的关系，建立中药-物理化学性质-药效学研究模式，对于将中药作为一个整体，解决中药质量控制和药效学物质基础都具有广泛的指导意义。

元胡又名延胡索，为罂粟科植物CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎。具有活血、行气、止痛的功效，主要用于气血瘀滞诸痛症[6]。历代对元胡的炮制有生用、炒、醋炙、酒炙、盐炙等[7]。2015版《中华人民共和国药典》载有生元胡和醋元胡。现代植物化学研究表明，元胡主要活性成分为异喹啉生物碱类，主要有原小檗碱型，原阿托品碱型，阿朴菲型，苯并菲啶型等[8-10]。药理学显示元胡除了具有非常好的镇痛作用外，对心血管系统疾病和肿瘤都具有良好的治疗作用[11]。目前关于元胡的化学物质基础和药理作用研究较多，但关于其物理化学性质及其与药效作用之间的关系尚未见研究报道。故，课题组在前期研究的基础上，研究了元胡醋炙前后水提液物理化学性质的变化，并将其与两者的抗肿瘤细胞活性联系起来，对于探索建立中药-物理化学性质-药效学研究模式提供实验基础。

1 材料

1.1 实验仪器

TGL-20B离心机(上海安亭科学仪器厂)、HH-S4型数显恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)、ZDHW调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)、黏度计(美国BROOKFIELY 博力飞))、VaCo型低温冷冻干燥仪(Zirbus technology)、PHSJ-4F实验室PH计(仪电科学仪器)、DDS-307电导率仪(上海精科)、激光粒度分析仪(Malvern 3000)、CO2恒温培养箱(Sanyo公司)、Thermo 热点Multiskan FC酶标仪(美国Thermo公司)、高温灭菌锅、96孔细胞培养板、TS100-F显微镜(Nikon公司)、超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.2 实验细胞株

人肝癌细胞株HepG2、人肺癌细胞株A549均购自西安运达生物科技有限公司。

1.3 药品与试剂

元胡中药材，经陕西中医药大学生药教研室主任王继涛高级实验师鉴定为罂粟科植物CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎(陕西兴盛德药业有限责任公司，批号：20170101)；醋元胡中药材，经陕西中医药大学生药教研室主任王继涛高级实验师鉴定为罂粟科植物CorydalisyanhusuoW.T.Wang的醋制干燥块茎(陕西兴盛德药业有限责任公司，批号：20170101)；蒸馏水(HyClone改良型RPMI-1640)；培养液(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；胎牛血清(美国Biological Industries 公司，批号：1552680)；MTT；磷酸缓冲液；0.25%胰蛋白酶(Solarbio公司，批号：20170315)；无菌水；去离子水；DMSO。

2 实验方法

2.1 元胡与醋元胡水煎液的制备

称取元胡20.0 g，加10倍量的水即200 mL，浸泡30 min，煮沸后保持微沸1 h，滤过，取滤液备用。药渣加8倍量的水，再煎煮1 h，滤过，取滤液。两次滤液合并，浓缩并定容至100 mL，5000 r·min-1离心15 min，备用。

醋元胡水煎液的制备同上。

为避免实验误差，上述同一批号的药材重复三次实验操作，所得药液分别进行以下物理化学参数测定。

2.2 物理化学参数的测定

取上述制备的元胡和醋元胡水提液，均通过恒温槽控制在25 ℃，采用马尔文粒度仪测定水提液的粒径和Zeta电位，pH 计精密测定pH，电导率仪测定电导率，旋转式黏度计测定黏度。上述每组供试液重复测定三次。

将上述数据测定完成之后，将三次元胡的水煎液和醋元胡的水煎液分开合并，置于水浴锅上蒸发至浸膏状，-80 ℃冷冻24 h，然后置于冷冻干燥器中干燥24 h，取出，研成细粉，备用。

2.3 细胞培养

将HepG2和A549细胞分别消化于含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液(pH 7.0～7.4)中，在恒温培养箱中37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行传代培养。

2.4 受试药液的制备

精密称量元胡及醋元胡冻干粉50 mg，用空白培养液配成10 mg·mL-1母液，0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。将母液分别稀释4倍，10倍，即2.5 mg·mL-1、1 mg·mL-1，再将1 mg·mL-1稀释4倍，即0.25 mg·mL-1，置于4 ℃保存，备用。

2.5 MTT试验

分别取对数生长期的细胞株，调整细胞密度为每升5×107，接种于每孔200 μL RPMI-1640培养基的96孔板上，置于恒温培养箱中37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h，待细胞贴壁后更换新鲜培养液，每孔200 μL。实验组加入不同浓度(10、2.5、1、0.25 mg·mL-1)药品溶液，每孔终浓度分别为0、10、20、50、100、200、400、800、1200 μg·mL-1；同时设置对照组和调零孔，每个处理组设置3个平行孔。加药完毕后96孔板置于恒温培养箱中培养48 h后，换新鲜培养液(每孔180 μL)，每孔加入新鲜配制的MTT溶液(5 g·L-1)20 μL，继续在恒温培养箱中培养4 h。吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，每分钟60次，震荡10 min后，用酶联免疫标定仪测定490 nm 处吸光度(A)值，计算药液对肿瘤细胞生长增殖的抑制率。

2.6 统计学处理

3 结果与讨论

3.1 物理化学参数测定结果

对元胡和醋元胡水煎液各项物理化学参数测定结果如下表1所示。

表1 元胡与醋元胡水煎液物理化学参数测定结果

注：**表示醋元胡水煎液各参数与元胡水煎液各参数对比，P<0.01。

可以看出元胡水煎液的粒度、黏度、电导率小于醋元胡水煎液，而Zeta电位和pH大于醋元胡水煎液。为了更直观的看到这种变化规律，将这五种物理化学参数变化做成柱形图，如下图1：

从图中可以看出，醋炙后水煎液的粒度、黏度、电导率增加，而Zeta电位和pH都有所下降。其中粒度、黏度和电导率变化显著，Zeta电位和pH虽有变化，但不具备显著性。

注：A.元胡与醋元胡水煎液粒度、黏度、电导率、Zeta电位和pH变化图；B.A图单位过大，将电导率、Zeta电位和pH单独作图。图1 元胡与醋元胡水煎液物理化学参数

研究表明，生物碱是元胡的主要活性成分。许翔鸿等[12]从元胡中分离得到13个生物碱单体，其中12个结构明确，分别是d-紫堇碱、四氢巴马亭(延胡索乙素，THP)、去氢紫堇碱、巴马汀、四氢黄连碱、四氢小檗碱、异紫堇球碱、原托品碱、四氢非洲防己胺、Saulatine、海罂粟碱、脱氢海罂粟碱。张晓丽等[13]从元胡中分离得到紫堇明、氧海罂粟碱(oxoglaucine)、降氧化北美黄连次碱、山嵛酸、β谷甾醇、胡萝卜苷、香草酸、对羟基苯甲酸；Chen等[14]从元胡中分离得到13-甲基-巴马土宾及13-甲基-去氢紫堇萨明碱。

从上述研究可以看出，元胡中含有大量生物碱，且具有广泛的药理作用。另有研究表明，元胡经醋炙后其中的生物碱成分溶出明显增多[15-16]。生物碱为含N的一类次生代谢产物，经醋炙后形成醋酸盐而使其在水中的溶解性增加，从而溶出度增大。2015版《中华人民共和国药典》规定，醋炙时“加醋拌匀，闷透，置炒制容器内，炒至规定温度，取出，放凉。”[17]由此可以看出，醋炙后多余的醋酸基本挥发干净，而与元胡生物碱成盐中和的醋酸已不显酸性。由上述张晓丽的研究结果可以发现，元胡中还含有香草酸、山嵛酸及对羟基苯甲酸等酸性成分，故水煎液成酸性。醋炙前后pH变化不明显。

电导率可以反应出溶液中离子浓度的多少，醋炙后生物碱成盐，溶液中离子浓度也同时增加，故醋炙后水提液的电导率增加。Zeta电位是溶液体系稳定性的指标。如果颗粒带有很多负或正的电荷，即就是Zeta电位很高，其相互排斥，从而使整个体系趋于稳定。相反，如果颗粒带有很少负或正电荷，即Zeta电位较低，颗粒之间即会相互吸引，从而使整个体系不稳定。醋炙后，带负电荷的生物碱被醋酸的质子中和，水提液中生物碱浓度虽然增加，但其为中性的生物碱醋酸盐，故负电荷降低，Zeta电位同时降低，但不具有显著性。Zeta电位的降低引起了粒子之间的相互吸引，故整个体系的粒度增加，黏度同时也增加，且具有显著性差异。

3.2 醋炙对元胡提取液抗肿瘤细胞活性影响

用MTT法分别检测元胡和醋元胡水提液冻干粉在0～1200 μg·mL-1浓度范围内HepG2和A549细胞体外生长增殖的影响，所得实验数据处理后如下表1所示。

表2 元胡和醋元胡不同浓度提取液对HepG2和A549细胞的抑制率

从上表2可以看出，元胡和醋元胡水提液冻干粉在所选浓度范围内都对两种肿瘤细胞株有一定的抑制作用，且随着浓度的增大，抑制率也随之增大。为了更加直观看出这种变化，以抑制率对浓度作图，结果如下图2所示：

注：A.元胡和醋元胡不同浓度提取液对HepG2的抑制作用；B.元胡和醋元胡不同浓度提取液对A549的抑制作用。图2 元胡和醋元胡不同浓度提取液对HepG2和A549细胞的抑制作用

从上图可以看出，元胡和醋元胡水提液冻干粉对HepG2和A549细胞的生长增殖都有一定的抑制作用，且抑制率随浓度的增加而增大。在所选浓度范围内，元胡水提液冻干粉对两种肿瘤细胞生长增殖的抑制作用弱于醋元胡水提液冻干粉。元胡中的主要活性成分为生物碱类，而醋炙的过程会使元胡中生物碱成分溶出增加，故其活性强于生品，这也是元胡炮制的主要原因。

4 讨论

中药水提液既是数千年中医药传统用药习性的沿袭，又是中药制药工艺过程中最基本的中间产物。从物理化学角度出发，中药水提液可被视为一种由混悬液、乳浊液与真溶液共组而成的十分复杂的混合分散体系。中药水提液的宏观性质，可用其各种物理化学表征参数描述，而这类物理化学表征参数，既来源于中药水提液中各种物质的化学组成，又是水提液体系中各种物质不同表现的综合反馈[18]。

元胡具有行气、活血、止痛的功效，临床常用其醋炙品。现代药理研究表明，元胡主要活性成分为异喹啉生物碱类，且具有良好的抗肿瘤作用。本文着重研究中药元胡在醋炙前后水提液物理化学性质的变化及对其肿瘤细细胞活性的影响。从实验结果可以得出，醋炙后随着生物碱溶出的增加，水提液的Zeta电位和pH有所降低，但不显著，而粒度、黏度和电导率则显著增加。这些参数的变化与醋炙过程中生物碱与醋酸反应形成醋酸盐而增溶密切相关。MTT实验结果表明，醋炙后的元胡水提液冻干粉对HepG2和A549细胞的抑制作用强于元胡水提液冻干粉。

中药水提液的物理化学性质与其所含化学成分密切相关，而这些化学成分又是中药得以发挥药效作用的物质基础[18]。因而，本文将元胡和醋炙元胡水提液的物理化学性质与其抗肿瘤活性进行关联研究，在揭示元胡醋炙对其水提液物理化学参数及抗肿瘤细胞活性影响的同时，也是对建立中药-物理化学参数-药效学研究模式的一次探索。而这一切变化都源于醋炙后中药自身化学成分的变化。中药是一个复杂的体系，含有多种化学成分，当前尚无任何一味中药的化学成分被完全研究清楚。古人将中药作为一个整体，提出了其性、味、归经以指导临床用药。中药药性作为遣方用药最基本的理论，与中药的功效密切相关。在中医药现代化的今天，中药药性的研究仍然是中药学研究的重点领域。将液体物理化学参数的概念引入到中药水煎液研究当中，借助现代科学可量化的参数，表征传统药液的性质。每味中药所含化学成分不同，因此其水煎液所具有的物理化学参数必然不同。同时，每味中药也有着自己独特的药效，而这些药效往往通过所含化学成分来发挥作用。因此，构建中药-物理化学参数-药效学之间的关系，从新的视角去审视中药，借助现代溶液性质研究中药的物理化学参数，另避蹊径，探寻中药自身的变化规律，对解决中药质量控制和药效学物质基础都具有重要的指导意义。