气相色谱-质谱法同时测定人体尿液中16种邻苯二甲酸酯

张 力，雍 毅，黄 祥，侯 江，胡 颖，罗 利，吴 怡

(1. 四川省环境保护科学研究院，四川 成都 610041; 2. 四川省环境保护重金属污染防治重点实验室，四川 成都 610041;3. 四川大学华西第二医院妇产科，四川 成都 610041)

0 引 言

邻苯二甲酸酯（phthalate acid esters, PAEs），又称酞酯、酞酸酯，常作为增塑剂和软化剂应用到塑料工业，效果显著而成本低廉[1]。同时，它也是一种环境激素类内分泌干扰化合物（endocrine disrupting chemical, EDC）[2]，会导致人体生殖功能障碍、发育行为障碍及其他与雌激素调解失衡的有关病症[3-4]。

塑料是目前最通用、最受欢迎的材料，被各行各业广泛的使用，极大便利了人们生活。但是，由于邻苯二甲酸酯在材料中并没有与材料以共价键结合，含邻苯二甲酸酯的材料在生产、使用过程中和弃置后，邻苯二甲酸酯均会源源不断地释放到周围环境中，并通过生物富集作用、体表接触和呼吸进入人体，从而影响人体内分泌系统，成为人们潜在的健康隐患[5]。欧洲化学品管理署（ECHA）2010年公布的第1份REACH法规“高关注物质名单”中共有16种高关注物质，其中有BBP、DBP和DIBP 3种邻苯二甲酸酯类增塑剂[6]。美国则早在1977年就将6种邻苯二甲酸酯类化合物列入重点控制污染物名单[7]。

本方法采用气相色谱-质谱联用技术结合液液萃取和高速离心分离的前处理方法，对某医院采集的人尿中的16种邻苯二甲酸酯进行了定量分析，为更精确、全面地评价邻苯二甲酸酯在人体中的内暴露程度提供科学依据。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

1.1.1 实验试剂

标准物质：16种邻苯二甲酸酯混标（美国AccuStandard），纯度不低于99.9%。色谱纯正己烷购自德国CNW公司。

1.1.2 实验仪器

美国 Thermo Fisher Scientific 公司 TRACE1310气相色谱+ITQ700质谱联用仪，带AI/AS1310自动进样器；KQ-500DE型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；N-EVAP-112氮吹仪（美国Organomation Associates）

1.2 样品的预处理方法

本实验采用液液萃取的方法对尿液样品进行前处理。移取尿液4 mL于离心管中，加入0.4 g氯化钠混匀，分别用1 mL正己烷提取3次，离心机4 000 r/min 离心 10 min，收集并合并正己烷层，用0.22 μm有机系PTFE滤头过滤，40 ℃下氮吹至半干，正己烷定容至1 mL，进行GC-MS分析。

1.3 GC-MS测定条件

1.3.1 GC-MS 色谱条件

色谱柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；升温程序：初始温度 60 ℃，保持1 min，以 20 ℃/min 升温至 220 ℃，保持 1 min，再以 5 ℃/min 升温至 280 ℃，保持 4 min；载气：氦气（纯度≥99.999%）流量 1 mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL。

1.3.2 GC-MS 质谱条件

电离方式：电子轰击源（EI）；电离能量：70 eV；离子源温度：250 ℃；色谱与质谱接口温度：280 ℃；溶剂延迟：5 min；检测方式：选择离子扫描模式（SIM），监测离子见表1；外标法定量，用保留时间及特征离子定性、定量分析。

表1 16种邻苯二甲酸酯的保留时间、定性离子及定量离子

2 结果与分析

2.1 16种邻苯二甲酸酯的GC-MS分析

本方法使用HP-5MS毛细管柱，进样溶剂为正己烷，进样量不能大于2 μL，过大的进样量会导致溶剂效应或使色谱柱过载，降低检测效果，进样量过小，方法灵敏度则达不到方法要求，故选择1 μL为本方法进样量；邻苯二甲酸酯沸点较高，故进样口温度设置为250 ℃，使样品在衬管中完全汽化，柱温箱最高温度和接口温度设置为280 ℃，以保证色谱柱和接口洁净无残留。方法优化了气相色谱柱温箱升温程序，降低了220～280 ℃的升温速率，使性质相似、保留时间相近的峰分离良好。此色谱柱最佳载气流量为1～2 mL/min，较低的流量可以增加峰分离度，故将载气流量设置为1 mL/min。

为了提高检测灵敏度和重现性[8-10]，避免样品中其他组分的干扰，本方法采用选择离子检测的模式（SIM）。在选择离子检测模式下，质谱检测器只检测选定的特征离子，与全扫描模式相比，在相同的扫描模式周期内，选择离子模式检测每个离子的时间更多，检测灵敏度提高了5～100倍[2]。使用16种邻苯二甲酸酯混标在1.3条件下进行实验，得到选择离子模式（SIM）色谱图，见图1；16种邻苯二甲酸酯的保留时间、定性离子及定量离子见表1。

图1 16种邻苯二甲酸酯的选择离子检测模式（SIM）色谱图

2.2 样品前处理方法的优化

PAEs是亲脂性有机物，其辛醇-水分配系数较高，水溶性低，易溶于正己烷、二氯甲烷等大部分有机溶剂[11-12]。方法比较了正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯3种有机溶剂作为提取溶剂对PAEs的提取效率。结果表明，3种提取溶剂对水中PAEs的提取效果相近；3种溶剂中，正己烷非极性最强，萃取的杂质最少，同时，二氯甲烷毒性较强，乙酸乙酯挥发性较弱，而正己烷兼具低毒、易挥发的优点，故选择正己烷作为样品的提取溶剂。固相萃取等常用净化手段净化过程中萃取柱体、容器等的PAEs污染难以消除。同时，人体尿液样品采集不易单个样品体积小，轻微的污染将带来巨大的误差，故方法未对提取液进行净化。

2.3 方法线性范围、检出限（LOD）和定量下限（LOQ）

采用外标法对样品进行定量分析，将16种邻苯二甲酸酯混标母液用正己烷梯度稀释成浓度为0.05，0.1，0.5，1，2，4 mg/L 的系列标准溶液；分别以各组分特征定量离子的峰面积Y对相应质量浓度X作线性回归，得出线性方程及相关系数。从结果可以看出，16种邻苯二甲酸酯在0.05～4 mg/L质量浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数r2≥0.99。以3倍信噪比（S/N）确定方法检出限（LOD）为 0.001～0.017 mg/L，10 倍信噪比（S/N）为定量下限（LOQ）0.002～0.056 mg/L，详见表2。

2.4 实验空白

邻苯二甲酸酯广泛存在于塑料制品和包括实验室在内的各种环境中，故实验中用到的所有器具均为玻璃制品，使用前将器具用正己烷润洗，在通风厨晾干，以保证器具干净。使用后实验器具均用肥皂水擦洗，并在30 ℃下超声10 min，自来水洗净，再用超纯水淋洗后在烘箱中以100 ℃烘烤2 h，以降低空白值。以生理盐水作为空白尿样按本方法处理并检测，空白尿样在邻苯二甲酸酯对应保留时间处峰面积均小于标准曲线最低点该物质峰面积20%，DHXP定量离子m/z=149色谱图如图2所示。

2.5 方法准确度和精密度实验

根据中国药典（2015）通则9012《生物样品定量分析方法验证指导原则》，采用分析方法的准确度（重复性）描述该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度（一般用加标回收率反映方法的准确度），精密度为测量值的相对标准偏差（变异系数）。本文用同一份均匀人体尿液样本分别加入标准工作液配制高、低2个浓度级别的质量控制样品，每个浓度级别8份样品，按照前文所述方法对原样和加标样品进行检测，得到加标回收率和相对标准偏差如表3所示。可以看出，除DIBP外，加标样品8次测定的回收率在80%～120%之间，两种浓度梯度下DIBP回收率均偏低，但高加标量回收率更高，可能是因为样品未经过净化，DIBP受到杂质干扰，导致回收率偏低，提高加标量时，进样量和前处理程序一致，DIBP的量增加而杂质的量并没有明显变化，回收率得到提高；除低浓度级别样品DMP、DEP、DIBP和 DBP外，RSD均低于 10%，方法精密度和准确度满足分析要求。

表2 16种邻苯二甲酸酯的方法线性方程、相关系数、线性范围、LOD和LOQ

图2 标准曲线最低点和空白尿样DHXP定量离子m/z=149色谱图

2.6 实际样品的测定

收集了90份成都市某医院人尿样品，利用试验建立的方法对其进行测定，扣除空白值后，DIBP、DBP和DEHP等10种邻苯二甲酸酯均有检出，其中DBP和DIBP检出率高达77%和50%，DEHP检出率也达到22%。表明成都市采样人群中主要暴露的污染物为DBP、DIBP、DEHP和DNP。采样人群尿液样品PAEs含量范围和检出率见表4。

3 结束语

本文采用正己烷提取、气相色谱-质谱（GC-MS）技术，建立了测定人尿中16种邻苯二甲酸酯的分析方法。方法检出限（LOD）为 0.001～0.017 mg/L，定量下限为 0.002～0.056 mg/L，除 DIBP 外，所有组分回收率在80%～120%之间；DMP、DEP、DIBP和DBP4种组分低浓度级别样品RSD较高，其他组分高、低两个浓度级别样品RSD均小于10%。本方法前处理过程简单方便、检测灵敏度高、线性范围宽，满足人尿中邻苯二甲酸酯的定性和定量检测的需求，对邻苯二甲酸酯在人体的内暴露评价有一定参考意义。

表3 16种邻苯二甲酸酯的回收率与相对标准偏差

表4 成都市某医院人尿样品PAEs含量范围和检出率