泛素结合酶E2 A 在顺铂诱导的HeLa细胞应激反应中的作用

2018-12-07 03:16王玉强李红娟蒋天靓曹亦菲
癌变·畸变·突变 2018年6期
关键词:条带试剂盒实验组

王玉强,李红娟,蒋天靓,曹亦菲,杨 军,2,*

(1. 杭 州师范大学医学院,浙江 杭州310016;2. 浙江大学附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,浙江 杭州 310003)

顺铂(cisplatin)自研制成功以来已经成为治疗多种肿瘤的一线药物,如卵巢癌、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、肺癌等[1-2]。DNA是顺铂作用的重要靶点,可以诱导链内交联(intrastrand crosslink)、链间交联(interstrand crosslink)、DNA-蛋白质交联(DNA-protein crosslink)等的形成,从而激活细胞应激反应(cellular stress response),最终可导致细胞周期停滞或者细胞死亡[3-4]。但是对顺铂的耐药是困扰其临床应用的一个重大问题,因此,更加深入了解顺铂诱导的细胞应激反应的分子机制可以为改善顺铂的治疗效果提供新的思路和靶点。

针对这一问题,我们尝试通过对基因表达谱的分析,发现和鉴定与顺铂诱导的细胞应激反应有关的基因和信号通路。前期研究结果发现顺铂作用宫颈癌HeLa细胞后可导致许多基因表达水平的改变,包括已知的p53、p21、NDRG2、Bcl-2等基因[5-7]。同时,我们还发现了许多未被报道的参与顺铂诱导细胞应激反应的基因,如人源泛素结合酶E2 A(ubiquitinconjugating enzyme E2 A,UBE2A)基因。UBE2A基因的研究相对较少,其功能仍然不明确,但已有的研究结果提示它可能是一种与DNA损伤修复相关的基因,与肿瘤的发生、发展和转归有一定的关系[8]。因此,本研究针对UBE2A在顺铂诱导的细胞应激反应中的作用开展了进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

HeLa细胞株为杨军教授课题组保存;DMEM高糖培养基、胰酶-EDTA、青/链霉素均购自杭州吉诺生物医药技术有限公司;胎牛血清购自美国Biological Industries;LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司;RNA提取试剂盒RNAiso Plus、反转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM均购自日本TaKaRa公司;PCR试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司;CCK-8试剂购自上海碧云天生物技术有限公司;琼脂糖购自美国Hydragene公司;顺铂购自美国Sigma公司。人UBE2A基因特异性siRNA Oligomer和阴性对照(RNAi negative control)由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成,人UBE2A基因特异性siRNA Oligomer 包括针对转录本1(NM_003336.3)的UBE2A-homo-434、UBE2A-homo-461和针对UBE2A基因全部转录本的UBE2A-homo-257、UBE2A-homo-468。具体序列见表1。

表1 人UBE2A基因特异性siRNA Oligomer序列

1.2 细胞培养

HeLa细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基(内含100 U/mL青霉素,100 μg/mL链霉素)在37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下常规培养。

1.3 PCR扩增目的基因

根据GenBank报告的基因序列,利用Primer-BLAST设计1对PCR引物,由上海生工合成。引物序列:上游5"-AACCCGAGACCCCAGTGTAT-3";下游5"-GGACTCCAACGGTTCTGAAGT-3",预测产物长度为339 bp。

将处于对数生长期的HeLa细胞分别接种于6孔板,在贴壁细胞铺满底面积的70%~90%时分为对照组和实验组。实验组加入顺铂储存液(1 mmol/L)至终浓度为 10 μmol/L, 对 照 组 加 入 等 体 积 PBS。 24 h后 用RNAiso Plus提取两组细胞的总RNA,Nano Drop 2000检测总RNA浓度及纯度,按照反转录试剂盒说明书进行反转录。然后PCR扩增目的基因,PCR反应体系为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环;最后于72 ℃延伸2 min。PCR产物取10 μL,加入2%琼脂糖凝胶中电泳分离,紫外成像分析仪照相保留结果。

1.4 细胞处理条件及RNA提取

将处于对数生长期的HeLa细胞分别接种于6孔板,在贴壁细胞铺满底面积的70%~90%时分为对照组和实验组。实验组加入顺铂储存液(1 mmol/L)至终浓度分别为2.5、5、7.5、10、12.5 μmol/L,对照组加入等体积PBS。再分别于12、24、48 h后用RNAiso Plus提取各组细胞的总RNA,Nano Drop 2000检测总RNA浓度及纯度,按照反转录试剂盒说明书进行反转录。PCR扩增目的基因及琼脂糖凝胶电泳实验方法同1.3。

1.5 瞬时转染

根据GenBank报告的基因序列,利用Primer-BLAST设计2对PCR引物,由上海生工合成。引物1用来检测UBE2A转录本1的表达,序列为:上游5"-ACCA CCTACAGTTAGATTTGTCTCT-3";下游5"-CCTGGCTG TTTGCTGGACTA-3";引物2用来检测UBE2A全部转录本的表达,序列为:上游5"-TAGTCCAGCAAACAGCC AGG-3";下游5"-AAACTGTACCCGGGGTCAAC-3"。

将处于对数生长期的HeLa细胞分别接种于24孔板,在贴壁细胞铺满底面积的70%~90%时进行转染。转染按照LipofectamineTM2000试剂说明书进行。先将20 pmol siRNA Oligomer(实验样品)或RNAi Negative Control Oligomer(阴性对照) 稀释于50 μL的DMEM培养液中(无血清),轻柔混匀。再将1 μL脂质体LipofectamineTM2000稀释于50 μL的DMEM培养液中(无血清),轻柔混匀,室温静置3~5 min。将上述两液体混合,室温静置20 min。将混合液加入24孔板中混匀。转染24 h后,用RNAiso Plus提取各组细胞的总RNA,Nano Drop

2000检测总RNA浓度及纯度,按照反转录试剂盒说明书进行反转录。再按照实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)试剂盒说明书检测各组不同样本的CT值 (基本循环数) 以及各组样本中内参GAPDH的CT值 ,按照∆CT= CT,目标- CT,参照,值RQ。结束后记录实验组、对照组(等体积无血清培养基)及阴性对照组(RNAi negative control)的法计算实验组、阴性对照组与对照组之间UBE2A mRNA 表达量的关系。

1.6 瞬时转染及联合顺铂作用

将处于对数生长期的HeLa细胞分别接种于6孔板,在贴壁细胞铺满底面积的70%~90%时进行转染。转染按照LipofectamineTM2000试剂说明书进行。实验组分别加入UBE2A-homo-434、UBE2A-homo-257 siRNA Oligomer,对照组加入等体积的培养基。转染5 h后,消化细胞,转接于96孔板,设置空白组(只含培养基不含细胞)、对照组(含细胞)、顺铂处理组、UBE2A-homo-434实验组和UBE2A-homo-257实验组,各组均设3个复孔。转染24 h后,各组(除对照组)分别加入顺铂储存液(1 mmol/L)至终浓度为10 μmol/L,对照组加入等体积PBS。继续培养24 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂,37 ℃孵育1 h,选择450 nm波长,参考波长为650 nm,测定D(450)值,计算各组细胞的存活率。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 顺铂作用后UBE2A mRNA表达水平

利用RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳检测顺铂作用后HeLa细胞中UBE2A mRNA表达水平,结果发现PCR产物为2个条带,其中对应预测产物339 bp的条带较亮,而对应于249 b p位置的条带较弱,未见其他明显非特异性扩增杂带及拖尾现象(图1)。为明确这2个条带是否都是UBE2A转录产物,我们对其进行测序分析,根据探针序列及测序结果,我们发现这两个条带都是UBE2A转录产物,其中249 bp条带与339 bp条带相比,缺少了UBE2A基因外显子4的部分序列。该结果提示在HeLa细胞中,正常情况下UBE2A基因表达至少两个不同的转录本。为方便进一步研究,我们将339 b p条带命名为转录本1(U-1),249 bp条带为转录本2(U-2)。在顺铂作用HeLa细胞后,我们发现U-1和U-2的表达水平均升高(图1)。为了进一步验证上述结果,我们还检测了顺铂终浓度分别为2.5、5、7.5、10、12.5 µ mol/L及作用时间分别为12、24、48 h时U-1和U-2的表达水平,证实了上一实验结果的可靠性,并发现顺铂浓度为10µmol/L,作用时间24 h 时效果最明显,见图1。

图1 10 µmol/L顺铂作用24 h后UBE2A mRNA表达水平

2.2 瞬时转染HeLa细胞后UBE2A mRNA表达水平

为进一步研究UBE2A基因的功能,我们设计了针对U-1的siRNA(UBE2A-homo-434和UBE2A-homo-461);针对U-2的siRNA由于序列问题无法成功设计,因此只能设计针对全部转录本的siRNA(UBE2A-homo-257和UBE2A-homo-468)。其中针对U-1的UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-461 siRNA转染细胞24 h后采用qPCR检测U-1表达水平,发现U-1表达水平均降低,U-1表达量分别为对照组的27.43%、78.31%,差异均有统计学意义(P均<0.05),结果见图2。因此UBE2A-homo-434 siRNA转染后U-1表达水平更低,干扰效果更好。

图2 瞬时转染HeLa细胞后U-1表达水平

同样对针对UBE2A全部转录本的UBE2A-homo-257 siRNA和 UBE2A-homo-468 siRNA转染细胞24 h后采用qPCR检测UBE2A mRNA表达水平,发现UBE2A mRNA表达水平均降低,UBE2A mRNA表达量分别为对照组的15.81%、21.20%,差异均有统计学意义(P均<0.05),结果见图3。因此UBE2A-homo-257 siRNA转染后UBE2A mRNA表达水平更低,干扰效果更好。故后续实验选择UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA 进行研究。

图3 瞬时转染HeLa细胞后UBE2A mRNA表达水平

2.3 UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA转染对HeLa细胞在顺铂作用下存活率的影响

使用UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA转染HeLa后,CCK-8检测顺铂作用后细胞存活情况。结果显示,顺铂处理组、UBE2A-homo-434实验组、UBE2A-homo-257实验组细胞存活率分别为78.79%、64.33%、59.59%,转染UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA的HeLa细胞与对照和顺铂处理组相比,差异均有统计学意义(P均<0.05),结果见图4。这一结果提示,抑制 UBE2A转录本1或全部转录本的表达,可增加HeLa细胞对顺铂细胞毒性的敏感性,降低其存活率。

3 讨 论

顺铂作为最常用有效的化疗药物之一,广泛用于多种实体瘤包括宫颈癌的治疗[9]。但在许多患者中顺铂耐药限制了其疗效,影响了患者的预后。有研究显示,通过下调宫颈癌HeLa细胞中STAT3、Livin、Survivin基因的表达水平,均能够提高对顺铂细胞毒性的敏感性[10-12]。在前期基因芯片研究中我们发现,顺铂作用宫颈癌HeLa细胞后UBE2A基因表达水平发生改变,提示UBE2A可能参与了顺铂引起的HeLa细胞DNA损伤应激反应。在本研究中,我们进一步证明了UBE2A可被顺铂诱导表达。更值得注意的是在检测过程中发现该基因具有两个转录本,其中一个缺少了外显子4的部分序列(U-2)。

图4 抑制UBE2A表达及顺铂作用后各组细胞存活率

一个基因的不同转录本往往是变异剪接(alternative splicing)的产物。变异剪接是高等真核有机体在发育和应激反应中调控基因表达的一种主要机制,变异剪接能够调控一个蛋白是否被表达,或产生编码具有不同功能蛋白的pre-mRNAs,研究发现,接近94%的人类基因编码可发生变异剪接[13]。我们和他人在前期研究中已发现在外源化学物诱导的细胞DNA损伤应激反应中会出现变异剪接,而这些变异剪接异构体可能通过不同的方式对原来的蛋白功能发生影响,从而调控细胞的应激反应[14-15]。因此,对于UBE2A基因的两个不同转录本的功能研究就成为我们的关注重点。

RNAi作为一种干扰或封闭基因表达的工具而被广泛应用于实验研究中。本研究初始计划设计两组siRNA,分别针对人UBE2A基因的转录本U-1和U-2,但由于两个转录本间差异较小,无法设计出针对U-2的siRNA,因此改为针对UBE2A基因全部转录本的siRNA。本研究采用RNAi技术成功降低了UBE2A全部转录本(包括U-1和U-2)在HeLa细胞中的表达,再次证实了RNAi的有效性。

本研究结果显示,转染UBE2A-homo-434 siRNA和UBE2A-homo-257 siRNA的HeLa细胞与对照组相比,在顺铂处理后其存活情况出现明显差异,存活率较顺铂处理组分别下降了14.46%和19.20%,差异有统计学意义。此外,单纯抑制U-1表达与抑制全部转录本(U-1和U-2)相比,尽管有统计学意义,但推测U-1可能起着较为重要的作用。当然,从表达量比较,由于U-1表达显著高于U-2,可能掩盖了U-2的真实作用。因此,下一步我们将深入挖掘U-2 的生理学功能及调控机制。

综上所述,本研究利用RNAi技术成功降低了UBE2A全部转录本(包括U-1和U-2)在HeLa细胞中的表达,并由此显著提高HeLa细胞对顺铂细胞毒性的敏感性,提示UBE2A可能参与了顺铂诱导的细胞应激反应。本研究充实了UBE2A基因的功能研究,为改善顺铂的治疗效果提供新的思路和靶点。

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