GC7通过抑制eIF5A2活性增强槐耳醇提取物对胃癌细胞的增殖抑制作用

孙建城 王晓峰 倪益秀 朱浩特 徐志远 程向东⋆

胃癌在全球病死率高居第二位，目前常用手术联合化疗，然而术后易复发，化疗缓解率低而毒性高。研究发现，eFI5A2是重要的肿瘤促进分子，其含有hypusine残基，hypusine形成在蛋白调控细胞增殖和凋亡中发挥重要作用，其经hypusination活化后不仅可维持细胞的增殖，还能延缓肿瘤细胞的细胞周期［1］。GC7作为一种新型的高度亲和性和选择性的DHPS抑制剂［2］，通过抑制eIF5A2的hypusination抑制肿瘤细胞增殖［3］。在多种肿瘤细胞系（如胶质母细胞瘤［4］）中均已经观察到该化合物通过抑制eIF5A2的起抑制增殖作用，被认为是抑制肿瘤生长的有效途径。本中心采用多种提取方法提取槐耳正丁醇［5］，旨在探讨eIF5A2与胃癌细胞的增殖之间的关系，研究GC7与槐耳醇提取物联合对各种胃癌细胞的增殖抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及其培养 人胃癌细胞株MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27购自中国科学院细胞库，在37℃、5% CO2的二氧化碳培养箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化传代。

1.2 主要药物与试剂 槐耳醇提取物由浙江省中医院中心实验室提供，Deoxyhypusine Synthase Inhibitor（GC 7）购自Millipore公司。RPMI-1640细胞培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自Cellmo公司，0.25%胰蛋白酶消化液购自索莱宝科技有限公司，二甲基亚砜（DMSO） 购自Sigma 公司，PBS购自HyClone公司，CCK-8试剂盒购自东仁化学科技有限公司，anti-eIF5A2 antibody购 自abcam公 司，anti-GAPDH antibody，鼠二抗，兔二抗均购自Cell Signaling Technology公司，BCA 试剂盒，RIPA裂解液（Strong），TBS（PH8.0），10%SDS均购自康为世纪生物科技有限公司，30%丙烯酰胺溶液购自麦克林生化科技有限公司。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自Invitrogen公司。Western blot细胞裂解液、电化学发光液（ECL）试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 细胞增殖实验（CCK-8法） 收集对数期肿瘤细胞，按3×103个/孔接种于96孔板（100μl每孔），另设置一行空白组，不接种细胞。放回37℃培养箱继续培养24h后，吸弃原培养液，再分别加入100μl槐耳醇提取物溶液，药物浓度梯度为：31.25μg/ml，62.5μg/ml，100μg/ml，125μg/ml，250μg/ml共计五组，每个浓度梯度设置6个复孔，同时在空白组加入不同浓度梯度的槐耳醇提取物溶液；在对照组中加入不含药物的RPMI-1640培养液。培养24h后，按照说明书，向实验组、空白组和对照组各孔中加入10μlCCK-8溶液，放回培养箱继续培养30～90min后，放入全自动酶标仪中，设定测定波长为450nm，测定其吸光度（OD）值计算其均值。用公式计算细胞生长抑制率。实验重复三次。抑制率（%）=［1-（各实验组OD值-各空白组OD值）/（对照组OD均值-对应空白组OD均值）］×100%，应用SPSS 23.0计算其半数最大抑制浓度（IC50）。

1.4 Western blot 检测 提取各分组细胞蛋白，Bradford法蛋白定量后SDS-PAGE电泳及转膜，封闭液常温封闭1h。TBST漂洗3次，每次10min后，将一抗eIF5A2和GAPDH与一抗稀释液按照1：1000比例稀释，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次，每次10min，将二抗与5%牛奶按照1：3000比例稀释，4℃孵育2h。用TBST漂洗3次，每次10min后用ECL显色液显色。利用Alpha 凝胶成像系统及Photoshop CC 2017软件，对蛋白条带进行灰度扫描和分析。实验重复三次。1.5 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槐耳提取物对不同胃癌细胞的增殖抑制作用存在差异 通过CCK-8测定各种浓度梯度的槐耳醇提取物处理后的细胞存活率。细胞存活率随着槐耳醇提取物浓度的增加而下降，MGC-803细胞 的 IC50为（112.0±5.7）μg/ml，BGC-823细 胞的 IC50为（148.1±12.81）μg/ml，AGS细 胞 的 IC50为（192.7±10.65）μg/ml，HGC-27细 胞 的 IC50为（133.7±6.71）μg/ml。结果表明，槐耳醇提取物具有抑制胃癌细胞增殖的作用且MGC-803细胞对槐耳醇提取物最为敏感性，AGS细胞对槐耳醇提取物的敏感性最弱（见图1）。

图1 槐耳醇提取物对不同胃癌细胞系的增殖抑制作用

2.2 不同胃癌细胞表达的eIF5A2量存在差异 通过Western blot实验检测 MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27细胞中eIF5A2的表达量。结果表明，eIF5A2蛋白在不同胃癌细胞中的表达量存在差异，其中MGC-803细胞表达的eIF5A2蛋白量最少，AGS细胞表达的蛋白量最多（图2A）。通过Western blot实验检测槐耳醇提取物处理四种胃癌细胞24h后细胞中eIF5A2蛋白的表达量，槐耳醇提取物的浓度设为四种胃癌细胞相对应的IC50和1/2 IC50值。结果表明，槐耳醇提取物作用胃癌细胞后，不同胃癌细胞中eIF5A2的表达量不同程度的上调，随着槐耳醇提取物用药浓度的升高，eIF5A2表达量上调，与对照组相比具有统计学差异（P＜0.05）（图 2B-E）。

2.3 低浓度的GC7对胃癌细胞的增殖无抑制作用 据报道，低浓度的GC7对肺癌、乳腺癌细胞无影响，GC7对胃癌细胞的毒性尚未报道，为了确定GC7与槐耳醇提取物共同给药的适当浓度，进行了CCK-8实验以测试GC7在胃癌细胞MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27中的细胞毒性。结果显示：浓度在0～6.25μmol/L之间，低浓度的GC7对胃癌细胞几乎无细胞毒性，细胞存活率未受到明显影响（P＞0.05）。且已有研究证实，5μmol/L的GC7对其他癌症细胞（如肺癌、乳腺癌、膀胱癌）产生较小的细胞毒性，但是能特异性的抑制eIF5A2的hypusination，从而特异性抑制肿瘤细胞表达的eIF5A2蛋白活性。因此，作者使用5μmol/L的GC7，在不影响胃癌细胞活力又可以抑制eIF5A2激活的情况下与槐耳醇提取物共同给药。

2.4 GC7作用于不同胃癌细胞12h后，不同程度增强了槐耳醇提取物对胃癌细胞的抑制作用 通过CCK-8实验测试了5μmol/L的GC7作用胃癌细胞12h后，再用上述提到的各种槐耳醇提取物浓度作用胃癌细胞后观察细胞存活率。结果发现四种胃癌细胞的IC50均发生了改变，其中MGC-803细胞的IC50降低至（103.6±5.44）μg/ml，BGC-823细胞的IC50从原来的（148.1±12.81）μg/ml降低为（126.3±7.89）μg/ml，AGS细胞的IC50降低至（158.2±7.39）μg/ml，HGC-27细胞的IC50降低为（101.1±7.87）μg/ml。结果表明，在GC7作用四种细胞株12h后，槐耳醇提取物对胃癌细胞增殖抑制作用有不同程度提高，细胞存活率随着槐耳醇提取物用药浓度的升高而下降，其中MGC-803细胞的IC50变化差异无统计学意义（P＞0.05），AGS、BGC-823和HGC-27细胞的IC50变化差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 A：通过Western blot检测四种胃癌细胞MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27的eIF5A2表达量。B-E：用浓度梯度为不同细胞各自的IC50和1/2 IC50的槐耳醇提取物浓度处理（B） MGC-803 、（C） BGC-823、（D）AGS、（E） HGC-27细胞24h并与空白对照组细胞相比。通过Western blot实验测定eIF5A2的表达量（⋆P ＜0.05）。 ++：用不同细胞各自的IC50浓度的槐耳醇提取物处理胃癌细胞24h。+：用不同细胞各自的1/2 IC50浓度的槐耳醇提取物处理胃癌细胞24h。-：空白对照组。

3 讨论

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在我国是癌症防治的重点。细胞遗传学研究发现，人类数种恶性上皮性肿瘤细胞中染色体区存在高频扩增，提示这些区域可能存在某些癌基因，其扩增和高表达可能在恶性肿瘤发生、发展中发挥重要作用。在多种肿瘤中3q26染色体常表现扩增异常或不稳定，2001年，Guan等［6］从人卵巢癌细胞UACC-1598染色体3q26高扩增区内克隆出新的基因eIF5A2，该现象提示eIF5A2可能是肿瘤形成与转移基因。eIF5A2在人体大部分正常组织不表达，却在一些肿瘤细胞内（如卵巢癌和结肠癌内等）明显的特异性表达，即eIF5A2具有肿瘤特异性表达的特点。在动物实验中发现，eIF5A2的过度表达引起细胞的转化/锚地独立的增长，并使裸鼠致瘤［7］。本研究发现，四种胃癌细胞株中均发现了eIF5A2表达，其中表达eIF5A2蛋白高的胃癌细胞AGS、BGC-823、HGC27比表达低的MGC-803细胞对槐耳醇提取物的敏感性低，槐耳醇提取物对细胞的增殖抑制作用弱，提示eIF5A2蛋白可能影响胃癌细胞对槐耳醇提取物的敏感性，且表达越高，槐耳醇提取物对肿瘤的增殖抑制作用越弱。总之，本研究表明eIF5A2蛋白可能与胃癌的形成有关，且其表达量的高低可能影响了胃癌细胞对药物的敏感性。因此，研究eIF5A2在胃癌中的表达，为临床提供更多的综合治疗胃癌的方案，判断临床预后、提高胃癌患者的生存质量具有重要的临床意义。eIF5A2也许可作为胃肿瘤一种新的分子诊断或预后的指标，甚至在不久的将来能作为抗肿瘤治疗的分子靶点。我们需要一种既能针对耐药靶基因的，又能与传统药物联合治疗以增强传统化疗药物疗效，副作用较轻的药物，而GC7抑制eIF5A2的hypusination被认为是抑制肿瘤生长的有效途径。鉴于GC7对胃癌患者的潜在治疗可能，本研究结果对于胃癌患者的治疗具有重要的生物学意义。槐耳清膏被证明具有促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的分裂，逆转肿瘤细胞的耐药性等作用，被认为具有良好的抗肿瘤效果和较低的毒副作用，金克颗粒在临床上用于胃癌、乳腺癌、肝癌等的治疗。本次试验中发现，本中心自主提取的槐耳醇提取物能抑制胃癌细胞增殖，胃癌细胞的存活率随着槐耳醇提取物浓度的升高而降低。不同eIF5A2表达量的胃癌细胞对槐耳醇提取物的敏感性不同，且eIF5A2表达量高的胃癌细胞对槐耳醇提取物的敏感性低，eIF5A2表达量低的胃癌细胞对槐耳醇提取物的敏感性高，表明eIF5A2的表达量的高低在一定程度上会影响槐耳醇提取物对胃癌细胞的抑制作用。作者发现，胃癌细胞在用槐耳醇提取物处理24h后，其eIF5A2的表达量会升高，表明eIF5A2蛋白可能有助于胃癌细胞抵抗槐耳的作用。本实验发现GC7对eIF5A2的抑制作用有助于提高槐耳醇提取物对胃癌细胞的增殖抑制作用，GC7显著增强了胃癌细胞AGS、BGC-823、HGC-27对槐耳醇提取物的敏感性。但是，因以上主要为槐耳醇提取物在抗肿瘤方面的体外实验研究，其结果可能受药物本身、离子浓度和渗透压等因素的影响，因此，下一步还需继续在动物荷瘤模型中研究，进行体内研究来验证槐耳醇提取物对胃癌的抗肿瘤效果，促进其以后在临床上的应用。