探讨FISH技术在检测MDS患者5种常见骨髓染色体异常中的应用价值

朱炳伟 刘永林⋆ 彭来君

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组起源于造血干细胞的异质性髓系克隆性疾病，其主要特点是髓系细胞分化及发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少、造血功能衰竭，转变为急性髓系白血病（AML）的风险性较高［1-2］。染色体异常克隆是MDS的特点之一，应用常规染色体核型分析（CC）能发现约40%～70%的MDS患者存在非随机的染色体异常克隆。本研究对70例MDS患者骨髓进行5、7、8、20号和Y染色体荧光探针信号分析，并与CC结果进行比较，观察不同类型MDS患者的染色体异常，初步探讨FISH技术在诊断MDS中的价值。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2013年3月至2015年10月在浙江省中医院血液科就诊的符合维也纳最低诊断标准［3］的MDS患者70例，其中男39例，女31例；年龄17～83岁，中位年龄 55岁。按 WHO 2008分型［4］：难治性贫血（RA）20例，难治性贫血伴环形铁粒幼细胞（RAS）4例，难治性血细胞减少伴多系发育异常（RCMD）17例，难治性贫血伴原始细胞过多-1（RAEB-1）13例，难治性贫血伴原始细胞过多-2（RAEB-2）10例，5q-综合征1例，骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病（MDS/MPN）2例，不能分类的MDS（MDS-U）3例。另选取10例在本院就诊的良性骨科疾病患者的骨髓细胞作为对照。

1.2 试剂与仪器 荧光原位杂交技术（FISH）试剂盒（批号：CNG0007）购自北京金菩嘉医疗科技有限公 司， 包 括 GLP CSF1R/GLP D5S23，D5S721；GLP EGR1/GLP D5S23，D5S721；GLP D7S486/CSP7；GLP D7S522/CSP7；GLP D20S108/CSP8和 CSP X/CSP Y共6组探针，荧光显微镜型号OLYMPUS BX-UCB，荧光原位杂交仪型号ABBOTT ThermoBrite。

1.3 常规染色体核型分析 抽取抗凝骨髓适量采用骨髓短期培养法进行细胞培养，每例标本选取≥20个中期分裂相细胞进行R显带核型分析，染色体核型描述按《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2013）》进行。

1.4 荧光原位杂交检测及阈值的建立 取抗凝骨髓液2ml，以0.075mol/L KCI溶液低渗处理后，以3：1甲醇冰醋酸溶液预固定，制备细胞悬液滴片、烤片，制备探针混合物，变性、加探针杂交、洗涤玻片并复染，立即盖上盖玻片。放在暗处15min后，在荧光显微镜下观察间期细胞的荧光信号，每份样本计算200个细胞。FISH阈值的建立： 采用良性骨科疾病患者的骨髓细胞10例设为正常对照组建立各探针的检测阈值。异常阈值=平均值

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FISH与CC总检出率比较 70例MDS患者中，联合应用两种方法共检出40例染色体异常，总阳性率为57.1%，其中FISH检测出35例染色体异常，阳性率为50.0%，CC检测出27例染色体异常，阳性率为38.6%。两种方法检测结果相一致的患者有52例（74.3%），其中FISH与CC均正常患者30例（42.9%），FISH与CC均异常患者22例（31.4%）；两种方法检测结果不一致的患者有18例（25.7%），其中CC异常而FISH 正常患者5例（7.1%），异常均分布在FISH探针检测区域以外（见表1）；FISH异常而CC正常患者有13例（18.6%），其中20q-和7q-异常各6例，5q-和+8异常各3例（见表2）。

表1 5例FISH正常而CC异常MDS患者

表2 13例CC正常而FISH异常MDS患者

2.2 FISH与CC对MDS常见染色体异常检出率比较 见表3。

表3 FISH与 CC对MDS常见染色体异常检出率的比较［n（%）］

2.3 染色体异常与WHO分型（2008）的关系 见表4。

表4 染色体与WHO分型（2008）的关系［n（%）］

3 讨论

MDS 的染色体异常主要以染色体缺失和数目异常（增加或丢失）为主，尤其是+8、-7/7q-、-5/5q-、20q-和-Y等5种最为常见，而染色体易位则较少见，约为5%［5］。本研究对所有70例MDS患者使用了6组覆盖上述5种MDS常见染色体异常的FISH探针进行检测，并与CC结果相比较。结果显示，CC染色体异常检出率仅有38.6%，稍低于国内外报道的异常比例，可能是由于43例CC正常的MDS患者中有3例可供分析的分裂象数目不足，故可能存在漏检，降低了染色体异常检出率。而FISH技术的染色体异常检出率高达50.0%，要明显高于CC。FISH技术检测显示最常见的染色体异常为20q-（20.0%）和+8（17.1%），其它异常检出率依次为-7/7q-（15.7%），-5/5q-（12.9%）和-Y（2.9%），染色体异常分布频率的顺序与国内李乐勒等［6］研究的结果基本一致，但与其它国家报道有较大差别。西方报道染色体异常中最常见的染色体依次为 -5/5q-，+8，-7/7q-，20q-，17p-，11（q23）异常及复杂或高度复杂异常核型等［7］，与本研究结果不符，这可能是和两者之间不同的种族和地域之间的差异有关。CC检测显示最常见的染色体异常为+8（10.0%）和20q-（8.6%），其它异常检出率依次为-5/5q-（7.1%）、-7/7q-（7.1%） 和 -Y（4.3%），FISH 技 术较CC将-5/5q-，-7/7q-，20q-和+8这4组染色体异常检出率分别由7.1%、7.1%、8.6%、10.0%提高至12.9%、15.7%、20.0%、17.1%，该结果表明FISH技术检测MDS患者-5/5q-，-7/7q-，20q-和+8的敏感性要高于常规染色体核型分析。

本研究70例样本两种方法检测共有52例（74.3%）结果一致，30例两种方法检测均为阴性，22例两种方法检测均为阳性，其中7例患者CC除检测出FISH的异常核型外，检测异常还累及1、4、9、13、15、16、17、18、20和22号染色体，说明CC比FISH能发现更多结构与数目异常，而本研究中使用的是间期 FISH，由于探针设计范围有限，一次只能检测一个或几个位点的已知异常，如果染色体异常克隆在探针设计范围之外，就无法检测到。本研究70例样本两种方法检测结果不符的患者有18例（25.7%），其中5例患者CC异常而FISH正常，这5例染色体异常均分布在FISH探针检测区域以外（见表1）；CC正常的MDS患者中由 FISH检测出了13例异常，核型分析出现漏报现象，其中20q-和7q-异常各漏报6例，5q-和+8异常各漏报3例，FISH对其中的5q-、7q-、20q-和+8这些CC漏报的染色体异常都能够准确检测出。其中10例样本FISH检测阳性细胞百分率仅为7.0%～16.0%，表明该10例患者体内可能存在小克隆的随机染色体异常改变，通过CC法容易漏检，余下的3例样本经FISH检测结果显示，阳性细胞百分率分别达到 32.0%、34.0% 和60.0%，但CC仍然漏检，这可能是由于可供核型分析的中期分裂相数量不足。因此，作者认为对于核型正常或者核型失败的MDS患者，FISH仍可以检测出10%～20%左右的染色体异常克隆，FISH 技术对于那些骨髓细胞少，分裂相不理想的标本尤其适合，检测敏感性更高。

本研究中70例MDS患者按WHO分型，其中RA比例最高，占20例（28.6%），其它分型依次为RCMD 17例（24.3%），RAEB-1 13例（18.6%），RAEB-2 10例（14.3%）和RAS 4例（5.7%）。根据FISH检测结果显示，在WHO分型各亚型中，染色体异常检出频率是不一致的，RA、RCMD、RAEB-1、RAEB-2和RAS的染色体异常检出频率由低到高依次为30.0%、47.1%、53.8%、60.0%和75.0%，可见MDS的分型与染色体异常克隆检出率相关，且异常克隆检出率随着病情的发展有增加的趋势。而CC法 RA、RCMD、RAEB-1、RAEB-2和RAS的染色体异常检出频率依次 为 15.0%、7.6%、69.2%、50.0%和 50.0%，CC除RAEB-1型染色体异常检出率要高于FISH以外，其它异常检出率均低于FISH，表明FISH技术在检测MDS各亚型中染色体异常的敏感性要高于CC。

综上所述，FISH技术对MDS 常见染色体异常检测的敏感性要比CC高，但是FISH技术因包含探针有限，不能完全替代CC在MDS检测中的作用，可以成为染色体核型分析的有益补充，对于那些CC检测失败或者正常的病例，有较高的应用价值。