自体富血小板血浆混合磷酸钙骨水泥修复椎体骨缺损的实验研究

郭瑛 贾连顺 吴维敏

[摘要] 目的 观察自体富血小板血浆（PRP）与磷酸钙骨水泥（CPC）混合物修复椎体骨缺损的效果。 方法 选取山羊18只，在每只羊L1～L6椎体侧方制备6 mm×10 mm圆柱形骨缺损。根据填充方法的不同将实验分为三组：实验组填充自体PRP复合CPC，对照组填充CPC，假手术组不填充。于术后1、3、6个月随机处死6只，通过影像学观察骨愈合情况。 结果 所有动物均顺利完成手术并存活。PRP中血小板数量约为全血中血小板量的5倍余，PRP中生长因子[血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）]的含量明显高于全血中生长因子含量（P < 0.05）。在术后各时间节点，实验组与对照组均有新生骨形成及骨水泥吸收，但实验组更明显，而假手术组空洞未见明显骨修复。 结论 PRP能释放大量的生长因子，与CPC混合后表现出很好的骨诱导和成骨性能。两者混合物用于椎体骨缺损时效果确切。

[关键词] 磷酸钙；富血小板血浆；椎体骨缺损；动物模型；羊

[中图分类号] R683.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（a）-0013-05

[Abstract] Objective To observe the effect of the mixture of autologous platelet-rich plasma （PRP） and calcium phosphate cement （CPC） in repairing vertebral bone defect. Methods 18 goats were included in this experiment. A 6 mm×10 mm cylindrical bone defect was prepared on the side of lumbar vertebral body（L1-L6） of each sheep. The experiment was divided into three groups according to different filling methods： the experimental group was filled by CPC in combination with PRP， the control group was filled with CPC， and the sham operation group was not filled. 6 goats were randomly executed after surgery for 1， 3， 6 months， then the bone healing conditons were observed by imaging examination. Results All animals successfully completed surgery and survived. The platelet count in PRP was about 5 times more than that in whole blood， and the contents of growth factors [platelet derived growth factor （PDGF）， transforming growth factor-β （TGF-β）， vascular endothelial growth factor （VEGF）] in PRP were significantly higher than those in the whole blood （P < 0.05）. In all time points after surgery， new bone formation and cement absorption could be observed in both experimental group and control group， but the experimental group was more obvious， while no significant bone repair sign could be seen in sham operation group. Conclusion PRP can release a large number of growth factors， and show great properties of osteoinductive and osteogenesis when combined with CPC. The composite is effective for the treatment of vertebral bone defect.

[Key words] Calcium phosphate； Platelet-rich plasma； Vertebral bone defect； Animal model； Goat

椎體骨缺损是临床常见的问题之一。自体骨、异体骨、生物材料等多种材料可供临床应用，但均有相应的优点与不足。随着微创技术的发展，特别是经皮椎弓根螺钉固定以及经皮椎体成形术、椎体后突成形术的发展，可注射性骨水泥逐渐为临床广泛使用。最常见的骨水泥材料为聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA），但其在固化过程中产生的热量易损伤邻近组织，增加邻近椎体骨折的风险，没有骨长入及骨诱导功能，并存在潜在毒性及过敏反应等，逐渐被认识到其并非骨填充的最佳生物材料。磷酸钙骨水泥（CPC）因其良好的生物相容性和骨传导性而逐渐应用于临床，但其作为骨组织工程应用的支架材料强度不足。而本研究试将富含各种生长因子的自体富血小板血浆（PRP）混合磷酸钙用于修复椎体骨缺损，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究经过解放军第一八七中心医院实验动物研究伦理委员会批准（批号院字第2016003）。海南本地山羊18只，月龄22～25个月，平均（23.67±1.28）个月，体重19～27 kg，平均（21.56±2.56）kg，雌雄不限，纳入前均未施行过麻醉或因病行其他药物治疗，且排除传染性疾病。术前常规行腰椎正侧DR及CT检查，排除病理性骨折及其他骨质异常情况。室内圈养15 d适应观察，发现体重稳定，进食、饮水及日常活动等指标无异常，未沾染疾病后准备施术，术前禁食36 h，禁饮6 h。所有动物均购自海南大学动物科学系动物养殖中心[动物编号SYXK（琼）-20140017]。

1.2 PRP制作及与CPC复合

制备全程严格无菌。造模前用两支预先装有1 mL复方枸橼酸钠抗凝剂的10 mL注射器，分别从羊股静脉抽取5 mL血液，一管用自动化血液检测仪进行血小板计数，另一管用作PRP制备，步骤如下：摇匀，置入离心管中，离心（2400 r/min）10 min，离心半径为15 cm，重力加速度为1500 g。液体分为上清液和红细胞两层，吸取全部上清液及交界面以下1～2 mm的红细胞至另一离心管，再次离心（以3600 r/min）15 min，弃上清液上3/4，剩余液体约0.8 mL，摇匀，即为PRP。依次吸入0.8 mL PRP、0.2 mL凝血剂（由1 mL 10%氯化钙与1000 U凝血酶混合而成）和少许空气，摇匀，6～10 s后，PRP凝成胶状物（图1）。用血红蛋白吸管吸取PRP 10 μL，用血小板稀释液稀释至2 mL后行血小板计数，余PRP与CPC按质量比1∶10，按一定的液固比加去离子水调成骨水泥膏体。

1.3 模型制作及实验分组

动物全身麻醉后取侧卧位，经腹膜后入路到过腰椎体侧方，用骨科专用高速钻头在每只羊L1～L6椎体侧方垂直矢状位各制备一个6 mm×10 mm圆柱形骨缺损，按照随机数字表法随机选取4个骨缺损进行材料填充，2个假手术未行材料填充。根据填充方法的不同将实验分为三组：实验组填充自体PRP复合CPC，对照组填充CPC，假手术组不填充。

1.4 观察指标

分别测定全血及PRP中的血小板数量，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）方法测定PRP中生长因子[血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）]的水平。实验动物术后分别存活1、3、6个月后处死，取各椎体标本大体观察，并行相关检查观察各组骨生长愈合情况。

1.5 统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用非参数Mann-Whitney U或者t检验比较两组间数据，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体情况及血液分析

所有动物均顺利完成手术并存活。各时间节点每组分别有12个椎体可供结果分析。羊全血中血小板计数值为（224.8±32.9）×103/μL（168×103/μL～274×103/μL），PRP中血小板计数值为（1312.2±108.3）×103/μL（1150×103/μL～1527×103/μL）。PRP中血小板数量约为全血中血小板量的5倍余[484%～717%，平均（588.8±62.8）%]。PRP中生长因子的含量明显高于全血中生长因子含量，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 骨缺损的修复

通过影像学观察，术后CT观察假手术组可见一个标准圆形低密度影，而实验组与对照组可见填充物的高密度影像，1个月后骨缺损高密度区域的边缘开始变得模糊，而假手术组仍然清晰。术后3个月，假手术组及对照组可见缺损边缘皮质有少许骨痂形成，但空洞内部仍无明显骨质生长，对照组空洞内填充物致密影仍清晰，实验组空洞内填充物边缘逐渐模糊，骨水泥有吸收。术后6个月，假手术组与对照组缺损边缘皮质形成骨性连接，形成“盖”，但假手术组内部空洞及对照组内骨水泥致密影仍无明显变化，而实验组空洞内骨水泥密度较前降低，边缘模糊带更清晰，范围更大，且部分密度与周边骨质密度相同，提示部分骨缺损已修复完成（图2）。

3 讨论

椎体骨缺损是脊柱外科医生临床常见问題之一。造成椎体骨缺损的原因有很多种，最常见于椎体骨折，特别是老年骨质疏松性骨折，通过外科手段恢复椎体高度实际上仅椎体外层骨皮质复位，而被压缩之骨小梁结构未能恢复正常解剖结构而留下空洞，也见于青壮年严重压缩或者爆裂、椎体高度丢失明显的骨折修复后的空腔。另外还包括脊柱肿瘤或者脊柱结核、感染等疾病行病灶清除后形成的骨质缺损。骨组织在损伤或丢失后有一定的再生能力，以恢复正常的构造和质地。但当骨缺损达到临界大小时，常不能通过正常骨再生过程愈合，绝大部分缺损被致密的纤维连接组织填充[1]。当缺损严重影响椎体强度及脊柱稳定时，需要对椎体进行填充修复。为避免此种情况发生，常需进行骨移植。自体骨因其具有骨形成（osteogenetic）、骨诱导（osteoinductive）、骨传导（osteoconductive）等性质而被公认为是金标准的骨移植材料。同时自体骨不会传播疾病，并且在其逐步吸收为新形成的骨组织替代过程不会引起免疫反应。但其缺点，如供骨量较少，取骨处相关并发症（如术区疼痛、血肿、感染，破坏正常解剖结构及致畸，以及增加医疗成本等）的发生限制了其应用。因此，各种生物或合成移植材料，各类促进骨再生的因子如生长因子、骨形成蛋白（morphogenetic proteins）、生物活性多肽、骨组织工程技术和多能干细胞（pluripotent stem cells）在过去几十年得到应用。异体移植物是合成的有骨传导性的骨替代物，其具有生物相容性好、供应充足、无免疫反应等优点。生物材料必须具有多孔隙的基质作用，能促进目标细胞的生长及成骨分化，从而有利于骨组织在其内部和周边生长[2]。在此过程中，生物材料中必须有能起细胞黏附作用的成分，并且必须具备合适稳定的环境以利于骨细胞的生长与分化，如缺乏相关特质，则必须与有类似功能的物质混合。CPC是近几年被广泛应用于临床的生物相容性高的材料，其主要成分为羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA），与骨中主要无机矿物质成分相同，因此较其他的生物材料（如氧化锆、氧化铝等）具有更好的骨传导性，同时其发生反应后早期形成流体，具有可注射性。随即可形成膏状物，可以塑性成不同的形状，以利于对不同形状的骨缺损进行填充。同时其微观下凹凸不平的表面利于各种生长因子的黏附及新骨形成。通过对PRP与CPC进行混合后的活体研究显示，其新骨的形成速度比单纯使用CPC高8%～10%[3]。但是，CPC仍然有一些缺点，比如其变硬后脆性增高，并且其可吸收性并不高，即使要明显高于PMMA。本实验研究发现，单纯CPC填充骨缺损后，6个内吸收程度并不高，同时在吸收的部位，骨形成并不多。当PRP加入CPC后，6个月内虽未见骨水泥完全吸收，但是大部分被吸收的骨水泥被新生骨组织爬行替代，两种材料复合显示了良好的成骨性能。

PRP是一种来源方便、成本低廉和创伤较小的，能提供大量自体生长因子和细胞因子的血液制品。诸多生长因子，像PDGF、TGF-β、血小板衍化内皮细胞生长因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PDEGF）、血小板源性血管形成因子（platelet-derived angiogenesis factor，PDAF）、胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、血小板因子4（platelet factor 4，PF-4）等，与细胞因子（cytokines）均由血小板α-颗粒分泌，能激发促进组织修复，同时能调节这些生物活性成分的蛋白同化及分解代谢功功能之间的动态平衡，以最优方式利用这些活性成分促进组织修复[4]。同时有研究发现生长因子在合适的支架中可以影响骨细胞的趋化、分化、增殖和合适，并且调节骨的重建与重塑[5]。目前临床及基础研究亟待解决的是，如何获得血小板中充足有效的活性成分，这也是导致PRP应用研究效果不一的重要原因。目前尚无PRP统一的制备标准，制备方法及工艺上的差异使产生的细胞种类和数量不同，最后导致生长因子和细胞因子的成分与含量、释放时间不同而影响最终实验或研究结果。目前PRP制备实验时主要分为一步离心法与两步离心法，临床主要是使用各个厂家提供的成熟设备。不管采用哪种方法与设备，保证最后PRP有充足的生长因子储备是最重要的条件。目前关于PRP起效时所需血小板含量尚无统一结论。Marx[6]认为在临床应用中，只有最终形成的5 mL体积的PRP中血小板计数达到1000×103/μL时才有治疗作用。但文中作者并未给出相关文献依据或临床证据。Graziani等[7]则认为当PRP中血小板含量比全血中血小板多2.5倍时，便能对成骨细胞及成纤维细胞产生积极影响。在现有能够证实PRP释放大量生长因子、促进成骨细胞分化的文献报道中，Mazzocca等[8]利用市售的3种不同商用PRP制备器械制备健康人血PRP，血小板计数分别为（378.3±58.64）×103/μL、（447.7±183.7）×103/μL、（873.8±207.82）×103/μL，三种PRP均能促进7种生长因子生长，但数值最高组的明显高于其他两组，而低值的两组则没有差异。Bi等[9]发现羊血PRP中血小板数量为（1205±118）×103/μL，较全血高5倍余，能显著促进PDGF-BB、TGF-β1、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、VEGF等四种因子释放。本研究与其最为接近，最终提示PRP通过CPC为支架促进生长因子的释放，诱导成骨细胞增殖分化，促进骨缺损内新骨形成。

在决定PRP最终治疗作用的因素当中，PRP制备时血小板的激活是使其产生效果的措施中关键的一环[10]。血小板的激活分为两步，血小板脱颗粒化使生长因子从α-颗粒中释放；接着纤维蛋白原发生分裂构建支架，这个凝固过程促进了血小板凝胶的形成，并且限制活性成分向指定区域趋化。血小板激活方式不但影响PRP凝固，而且不同的血小板激活方式导致血小板源性生长因子释放数量和释放动力的不同。目前用于血小板激活的引物主要有四种：氯化钙（CaCl2）、血凝酶及两者的结合物，以及Ⅰ型胶原。Cavallo等[11]通过采用健康人血对上述四种方式进行对照研究发现，使用Ⅰ型胶原激活时，TGF-β1、PDGF-AB和VEGF等三种因子的数量明显下降，而其余三种方式并无明显差异。同时使用Ⅰ型胶原后PRP没有凝固，而其他三种方式均在15 min内发生凝固，并且维持至24 h。Fufa等[12]虽然在实验中发现使用Ⅰ型胶原同样能形成PRP凝胶，与Cavallo等[11]研究结果相反，但在生长因子释放动力学观察中发现除了VEGF早期与长期释放两者无明显差异外，使用CaCl2和血凝酶混合物为血小板激活物时，TGF-β1和PDGF-AB在12 h內释放更显著，即使10 d内两者无明显差异。但考虑到生长因子的半衰期很短，只有几分钟到数小时，如果它们在PRP制备后不能立即从血小板释放出来，将会被其他组织降解。而生长因子的快速衰退，也将导致其无法很好地与去矿物质化的骨基质有效连结。因此本研究在制备羊血PRP中使用CaCl2和血凝酶的混合物作为血小板激活物，结果在30 min左右PRP凝固成胶体。

除了PRP的激活外，PRP的来源与制备后的疗效有关。本实验选取大型动物山羊为实验动物，避免了采用鼠、兔等小型动物实验时，由于小型动物自身血容量不足，往往难以足量采血制备自体PRP，需要使用同种异体血制备。而同种异体源性血液难以保证血小板的活性，更难以确保其能分泌生长因子。即使用同种异体源性血液能制备良好的PRP，实验动物体内所产生的抗小板抗体也将会降低PRP的活性。同时，PRP与CPC复合的比例也是影响最后结果的重要因素。一般情况下，可溶性高意味着更高的生物活性和更好的骨传导性能，但同时可溶性高的材料其稳定性较差，当骨传导还未发生时就会发生严重的降解，从而影响最终的实际效果。Chen等[13]通过体外实验发现，当PRP与CPC粉末按重量百分率（PRP的质量/PRP的质量+CPC的质量，wt%）为10%时，对PRP及CPC的弹性模量均有作用。9周后10wt%的PRP与CPC复合后相较于单纯使用CPC在骨组织再生方面的活性更高。本研究采用其制备方法对PRP与CPC进行混合，通过影像学发现术后6个月内，PRP复合CPC能较单纯使用CPC更好地诱导骨质生长，且吸收的骨水泥更好地被新生骨替代。

综上所述，通过二次离心法能获得高血小板含量的自体PRP。而其被CaCl2和血凝酶激活后，能释放大量的生长因子，当将其按10wt%与磷酸钙化骨水泥混合后，能发挥各自的优势，最终表现出很好的骨诱导和成骨性能。两者复合物用于椎体骨缺损时效果确切。

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（收稿日期：2017-11-20 本文編辑：张瑜杰）