超氧化物歧化酶1基因多态性与2型糖尿病患者周围血管病变风险的相关性

宋 娜， 刘 畅， 山秀杰， 苏东峰， 李丽慧， 葛晓春

(承德医学院附属医院内分泌科， 河北 承德 067000)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者发生血管并发症的主要原因之一是活性氧的产生[1]。糖尿病发生、发展中涉及多种氧化应激源，如葡萄糖自氧化、蛋白质的非酶促糖基化和内源性抗氧化酶等。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是内源性抗氧化酶的一种，具有将超氧化物歧化为过氧化氢的能力，过氧化氢被过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等酶催化形成水和氧气[2]。SOD酶家族包括位于细胞质、细胞核和溶酶体中的CuZn-SOD(SOD1)，位于线粒体基质中的Mn-SOD(SOD2)，和与基质和细胞外空间蛋白多糖结合的EC-SOD(SOD3)[2]。抗氧化酶编码基因多态性可能改变抗氧化酶的活性，从而导致胰岛素抵抗，β细胞功能障碍，葡萄糖耐量降低，最终导致糖尿病和相关并发症如周围血管病变等[3-4]。然而，较少有文献报道超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与糖尿病患者发生周围血管病变风险的相关性。本研究通过收集2015年7月-2017年7月承德医学院附属医院内分泌科收治的T2DM患者，根据其是否发生周围血管病变，将其分为观察组(有周围血管病变)和对照组(无周围血管病变)，分别测定2组SOD1基因rs2234694、rs17880487和rs74315452 3个SNP的多态性，分析其与T2DM患者发生周围血管病变风险的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2015年7月-2017年7月承德医学院附属医院内分泌科收治的T2DM患者为研究对象，入选条件：(1)均符合T2DM诊断标准[5]；(2)自愿参加本研究，并且能够正常交流。排除条件：(1)急、慢性肾、肝功能不全者；(2)急性感染者。本研究共纳入T2DM患者360例，男性188例，女性172例，年龄45～75岁，平均(58.35±13.5)岁。根据有无周围血管病变，将研究对象分为观察组和对照组。周围血管病变诊断标准：踝肱指数(ABI)≤0.9，提示存在下肢血管病变；运动时出现下肢不适同时ABI≥0.9也应该诊断为周围血管病变；动脉内膜中层厚度(IMT)>1.0 mm；斑块(单发、多发、弥漫)；管腔狭窄。本研究符合医学伦理学规定，并通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器全血基因组纯化试剂盒(美国Thermo Fisher公司)，iPLEX Gold 试剂盒(美国Sequenom公司)；MassArray质谱仪(美国Sequenom公司)，GeneAmp 9700聚合酶链反应仪(美国ABI公司)。

1.3血样采集及DNA提取采集受试者外周静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸二钾抗凝管中，-70℃冰箱保存；采用全血DNA纯化试剂盒进行DNA提取，操作步骤严格按照说明书进行。

1.4SNP分型采用Sequenom MassARRAY SNP基因分型技术对候选SNP位点进行分型。单碱基延伸引物委托上海生工生物工程技术服务公司进行设计和合成，反应在MassArray质谱仪中进行，基因分型使用Sequenom MassARRAY RS1000软件(美国Sequenom公司)进行。

2 结果

2.12组基本信息对比本研究中观察组和对照组各180例，其基本信息见表1。2组间性别、年龄、BMI、T2DM病程、收缩压、舒张压、合并患高血压、吸烟情况的差异均无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。

2.22组候选SNP的等位基因频率比较Rs2234694、rs17880487和rs74315452 3个SNP均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P-HWE>0.05)。观察组中rs2234694、rs17880487和rs74315452的最小等位基因C、T和C的频率均高于对照组(P<0.05)，见表2。

表1 2组基本信息对比

表2 2组候选SNP的等位基因频率对比

2.32组候选SNP的基因型频率比较观察组rs2234694位点的AC和CC基因型频率、rs17880487位点的CT和TT基因型频率、rs74315452位点的TC和CC基因型频率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4相关性分析Rs2234694位点在显性和隐性遗传模型下均与增加T2DM患者周围血管病变风险具有相关性(P<0.05)。Rs17880487位点在显性和加性模型下均与增加T2DM患者周围血管病变风险具有相关性(P<0.05)。Rs74315452位点在隐性和加性模型下均与增加T2DM患者周围血管病变风险具有相关性(P<0.05),见表4。

表3 2组候选SNP的基因型频率对比

表4 不同遗传模型下候选SNP与T2DM患者周围血管病变风险的相关性

3 讨论

T2DM患者的高血糖环境与血管并发症之间具有密切关系。研究报道，高血糖通过直接毒性作用(高渗透压和晚期糖基化终产物)和调节细胞内信号传导途径(例如醛糖还原酶途径、晚期糖基化终产物途径、活性氧中间途径和蛋白激酶C途径)诱导内皮功能紊乱[6]。会导致内皮增殖因子(胰岛素样生长因子1、转化生长因子β和血管内皮生长因子)的扩增，核因子kappa B(NF-κB)通路激活以及血管炎症，最终导致T2DM患者发生周围血管病变[7]。本研究着重分析活性氧途径中涉及氧化应激反应中的内源性抗氧化酶SOD1的多态性，结果表明SOD1基因上rs2234694、rs17880487和rs74315452 3个SNP均与增加T2DM患者发生周围血管病变风险具有相关性。

rs2234694即SOD1 35A/C，Flekac等[8]报道rs2234694与T2DM患者发生大血管病变有关，但与微血管病变无关。Ukkola等[9]报道在芬兰北部T2DM患者人群中，该位点的多态性与心血管疾病风险无关。而Ghattas等[10]报道在埃及人群中，携带rs2234694位点CC基因型的个体更容易发生T2DM。然而，Vats等[4]报道印度人群中不含有rs2234694位点的多态性，所有受试者均为AC基因型。本研究中，观察组rs2234694的最小等位基因C频率、AC和CC基因型频率均显著高于对照组，表明rs2234694位点的C等位基因可能是T2DM患者发生周围血管病变的风险等位基因。结合上述研究结果，笔者推测在T2DM的发生发展过程中，rs2234694位点的A>C突变可能起到重要作用，因此，临床上可以考虑对T2DM患者进行rs2234694位点的突变筛查，重点关注高危人群，提早采取预防措施，以达到早期干预与预防T2DM患者发生周围血管病变的效果。

rs17880487位点也位于SOD1基因上。Yoichiro等[11]对2 799名参与社区健康研究的受试者进行了长达10 a的随访，并对639个SNP进行基因分型，发现SOD1基因内的rs1041740和rs17880487与心血管死亡率有关。本研究报道rs17880487位点在显性和加性模型下均与增加T2DM患者周围血管病变风险具有相关性，然而其具体机制还需进一步的功能实验进行验证。

根据Pubmed数据，rs74315452位点T>C突变是一个错义突变，导致对于密码子翻译的异亮氨酸突变为苏氨酸。目前还未有报道该突变是否影响SOD酶的功能，然而本研究观察到rs74315452位点的TC和CC基因型频率均高于对照组，并且遗传模型结果表明该位点在隐性和加性模型下均与增加T2DM患者周围血管病变风险具有相关性，提示了该位点对于SOD酶功能的重要性，后续研究应关注该位点对于T2DM患者血管病变发生、发展的影响。

综上所述，超氧化物歧化酶基因SOD1上rs2234694、rs17880487和rs74315452 3个SNP可能与增加T2DM患者发生周围血管病变风险具有相关性。