豁痰解毒通络方对SD大鼠颈总动脉球囊损伤后炎性因子表达的影响

，， ，

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病(coronary heart disease，CHD)，其发病率逐年升高，经皮冠状动脉腔内血管成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)后再狭窄(restenosis，RS)是影响冠状动脉粥样硬化性心脏病介入治疗预后的关键问题。近年来，随着药物洗脱支架的研发及应用，再狭窄呈下降趋势。但药物洗脱支架术后不可避免的支架内再狭窄发生率仍达10%[1]，严重影响了远期疗效[2]是亟待解决的难题。探讨再狭窄的发病机制，寻求防治再狭窄的有效方法，成为心血管领域的研究热点和难点。多数中医学者认为，再狭窄仍属于中医“胸痹”“真心痛”等范畴。邓悦教授认为此病属脉络病，并提出“痰瘀伏络”可能是其关键病机，针对此病因病机应用豁痰解毒通络方加减，在临床应用中效果显著。本实验主要观察豁痰解毒通络方对大鼠颈总动脉球囊损伤术后肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)的影响，为PTCA术后再狭窄的防治机制研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 无特定病原体(SPF)级SD雄性大鼠，厂家：北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。体重380 g左右。

1.1.2 药物及试剂 豁痰解毒通络方组方：瓜蒌、金银花、当归、丹参等。中药饮片购自北京同仁堂大药房，在北京东直门医院实验室煎制；辛伐他汀(成都天银制药有限公司生产)，批号：国药准字H20083478；低分子肝素钠(吉派林)(杭州九源基因工程有限公司生产)，每瓶0.3 mL，批号：国药准字H19990035；戊巴比妥(北京化学试剂公司生产)，批号：020919；利多卡因(北京益民药业有限公司生产)，批号：H20083478；Trizol(总RNA抽提试剂)(美国Invitrogen公司生产)，批号：1201320；异丙醇(美国Invitrogen 公司生产)，批号：0942081；氯仿(美国Invitrogen 公司生产)，批号：2573130；酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(美国RD公司生产)，批号：2014089；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司生产)，批号：BBC0927A02。

1.1.3 实验仪器 球囊导管、压力泵(美国Medtronic 公司生产)，球囊直径为2 mm×20 mm；TGL-16B高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂生产)；微波炉(格兰仕有限公司生产)，型号：EG1140H；DYCZ-24DN迷你双垂直电泳槽(北京六一仪器厂生产)；聚合酶链反应(PCR)仪(美国PERKIN ELMER生产)，型号：GA9800；凝胶成像系统(美国自然基因科技有限公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立 大鼠称重，术前1 h于大鼠背部皮下注射吉派林，每只大鼠按500 U/kg注射；1%戊巴比妥钠，40 mg/kg，腹腔注射，将麻醉好的大鼠固定于鼠板上，刮去颈部毛发，暴露颈部皮肤，用碘伏消毒，铺盖洞巾。沿颈正中线将颈部皮肤剪开，暴露颈部肌肉；将颈内动脉远心端结扎死，术后不需打开，将颈外动脉远心端结扎；用动脉夹暂时阻断颈总动脉近心端；在颈内动脉远心端用虹膜剪剪一V型切口，将球囊插入血管内，松开动脉夹，将球囊近心端插入到尽量接近主动脉弓，但不要超过主动脉弓，大约4 cm长度；球囊远端连接装有生理盐水的压力泵，每次打入球囊的压力一般为50.7 kPa～81.1 kPa(0.5 atm～0.8 atm)，打完压力后，将球囊缓慢旋转抽出至颈总动脉远心端，将压力减至0 kPa，反复3次后撤出球囊；结扎颈内动脉近心端，解开之前在颈外动脉处打的结，恢复血流，缝合颈部皮肤，碘伏消毒伤口。假手术组只进行血管分离，不进行球囊扩张术。手术全程为无菌操作。

1.2.2 分组及给药方法 将造模动物随机分为模型组、中药组、西药组、中西药组，造模后第2天开始灌胃给药，模型组和假手术组给予生理盐水同体积灌胃；中药组给予豁痰解毒通络方汤剂，按生药16.33 g/(kg·d)给药；西药组给予辛伐他汀，按1.19 mg/(kg·d)给药；中西药组为以上两种药物合用，为确保给药体积一致，进行了浓缩。每只大鼠给药为每天100 g(1 mL)。全部大鼠普通饲料喂养。

1.2.3 取材及指标检测方法 于术后第28天腹腔麻醉动物。①ELISA法标本取材：腹主动脉取血，常规离心获得血清备用，用ELISA法检测血清中炎性因子TNF-α、IL-6的表达。②RT-PCR反应标本取材：取损伤侧颈总动脉，放入无核糖核酸酶(RNA酶)的EP管中，在液氮中进行保存，用于PT-PCR法检测颈总动脉组织中TLR4、IL-6的mRNA表达。所有检测方法严格按照产品说明书操作。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比较 模型组与假手术组比较，血清中TNF-α、IL-6的水平均升高(P<0.01)；中药组、西药组、中西药组与模型组比较，血清中TNF-α、IL-6的水平均降低(P<0.05)。表明中药组、西药组、中西药组都能够抑制血清中TNF-α、IL-6的表达。详见表1。

表1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6水平比较(±s) ng/L

2.2 各组大鼠IL-6、TLR4基因表达水平比较 模型组与假手术组比较，IL-6 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)；中药组、西药组、中西药组与模型组比较，IL-6 mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。表明中药组、西药组、中西药组均能降低IL-6 mRNA的表达。详见图1、表2。 模型组与假手术组比较，TLR4 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)；中药组、西药组与中西药组TLR4 mRNA表达水平较模型组降低(P<0.05或P<0.01)。表明中药组、西药组、中西药组都能够降低TLR4 mRNA的表达，中西药组效果更显著。详见图2、表2。

1：假手术组；2：模型组；3：中药组；4：西药组；5：中西药组

1：假手术组；2：模型组；3：中药组；4：西药组；5：中西药组

表2 各组IL-6 、TLR4 mRNA水平比较(±s)

3 讨 论

目前大部分学者认为再狭窄的发生与血栓形成、血管弹性回缩及血管内皮损伤、炎症反应密切相关。再狭窄是血管损伤后一种过度的自我修复，由多种细胞因子、炎性因子组成的信号传导通路介导的炎症反应，促使血管平滑肌细胞增殖，向血管内皮迁移，导致血管重塑，管腔变窄。大量研究表明，在再狭窄的发生发展进程中炎症反应发挥着重要作用。PTCA术后由于冠状动脉内膜的机械性损伤，引起血管内皮功能受损，活化的内皮细胞分泌多种黏附分子，促使白细胞与内皮细胞的黏附及活化，活化的白细胞和内皮细胞又可释放一系列炎症因子和趋化因子如TNF-α、IL- 6、白介素-8(IL-8)、TLR4等，一方面促进内皮细胞损伤进一步增加上述黏附分子的表达，促进了再狭窄的发生；另一方面，可直接促进血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖，促进内膜增生、血管重塑以致再狭窄的形成[3-4]。

本研究结果显示，经过球囊损伤的模型组TNF-α、IL-6、TLR4的含量显著升高(P<0.01)，说明存在炎症反应的发生。中药组、西药组及中西药组TNF-α、IL-6、TLR4的含量明显降低，中西药组则降低更明显，说明辛伐他汀及豁痰解毒通络方能够干预炎症反应的发生，而两者合用效果更为显著。

目前中医学者认为PTCA术后再狭窄的病因病机主要有血瘀、痰瘀互结、毒瘀互结等，并进行了大量的临床研究和实验研究，为PTCA术后再狭窄的干预和治疗开辟了新思路。有学者认为痰瘀伏络为本病主要致病机制[5-8]，以此为切入点，探讨PTCA术后再狭窄的发病机理，为本病的预防及治疗提供了理论依据。痰瘀伏络理论是在伏邪理论基础上发展而来的，伏邪理论最早见于《黄帝内经》，《素问·生气通天论篇第三》曰：“冬伤于寒，春必温病”。伏者，匿藏也。国医大师任继学教授指出：“伏邪即隐藏于人体之虚处”[9]。伏邪潜伏于人体正虚之处，指正气不足时，邪气未能及时清除，导致邪气留恋，潜伏体内，每遇外感六淫时邪，或七情内伤，饮食劳倦等因素引动，便可触发，或旧疾复发，或引发传变。痰瘀伏络理论是指痰瘀之邪，伏于血络，痰瘀互结潜伏于络脉。痰瘀伏络是心血管疾病的重要发病机制，为心血管疾病的治疗提供了重要靶标。根据痰瘀伏络这一致病机制，提出豁痰解毒通络方，方中包含瓜蒌、金银花、当归、丹参、水蛭等，以此方加减治疗，临床疗效显著[10]。本研究结果显示，豁痰解毒通络方能够明显降低TNF-α、IL-6、TLR4的表达，这些炎性因子又是很多炎性通路的重要分子。豁痰解毒通络方能够抑制炎症反应的发生，进而抑制PTCA术后再狭窄的进程。常宏等[11]应用益气活血解毒方对大鼠颈总动脉球囊损伤后炎性因子表达的影响进行研究，结果显示：益气活血解毒方能够降低C反应蛋白(CRP)、转化生长因子-β(TGF-β)等炎性因子的表达，抑制新生内膜的形成。

综上所述，炎症反应在PTCA术后再狭窄进程中的作用备受关注，本实验已经证实炎性因子在大鼠颈总动脉球囊损伤后有明显变化，而豁痰解毒通络方能够降低大鼠颈总动脉球囊损伤后炎性因子TNF-α、IL-6、TLR4的含量，进而抑制炎症反应的发生。由此证明，以痰瘀伏络理论为基础的组方用药能够减轻炎症反应，为中医药治疗PTCA术后再狭窄提供了新思路。