苯并呋喃类考布他汀类似物抗乳腺癌和宫颈癌细胞增殖作用初步研究

高祎婷， 海米提·肖合来提， 马 成

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

关健词： Combretastatin A-4(CA-4)； MTT； 乳腺癌细胞； 宫颈癌细胞； 分子对接

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势，2014年我国女性乳腺癌新发病例约为27.89万例，占女性全部恶性肿瘤发病的16.51%，位居女性恶性肿瘤发病的首位[1-2]。宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，发展中国家宮颈癌患病率远高于发达国家，在发展中国家宫颈癌患病率仅次于乳腺癌而居于第二位，我国女性宫颈癌发病率从高到低依次为中、西、东部地区，西部地区的死亡率最高，这与欠发达地区女性宫颈癌筛查普及度较低、人类乳头瘤病毒(HPV)感染率较高有关[3-4]。磷酯酰肌醇激酶(PI3K)是PI3K/Akt/mTOR通路的上游分子，正常情况下，PI3K催化PIP2磷酸化为PIP3，后者是细胞内的第二信使，通过募集和激活下游信号分子Akt，对Akt下游的信号蛋白如mTOR的磷酸化调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等[5]，在乳腺癌中PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化高达70%[6]。李锐锐等[7]研究发现，PI3K 抑制剂LY294002 能够增强宫颈癌细胞对放疗的敏感性，并表现出时间依赖效应，因此抑制此通路中的关键基因PI3K，能达到抑制乳腺癌和宫颈癌细胞的增长作用，引起癌细胞凋亡[8-9]。微管蛋白抑制剂对有些多药耐药肿瘤细胞(如非小细胞肺癌、前列腺癌和卵巢癌等)具有良好的抑制作用，有些微管蛋白抑制剂同时还具有肿瘤新生血管抑制作用[10]，CA-4是从南非灌木(Combretumcaffrum)的树干中分离得到的一种化合物，具有较强的抗微管蛋白活性，作用于秋水仙碱位点[11]。由于其水溶较差，易形成热力学上更稳定，但活性更弱的反式CA-4异构体，因此临床上较难用药[12]。Kamal等[13]采用苯并呋喃环取代CA-4的B的环，设计和合成出一系列CA-4的衍生物，对人肺癌细胞A549的IC50值为0.08 μmol/L，显示苯并呋喃类化合物具有良好活性，本研究对合成的苯并呋喃结构的CA-4类衍生物(化合物I)[14-15]进行体外抗乳腺癌及宫颈癌活性研究，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器371型CO2恒温箱(美国Thermo公司)，680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)，SSW-420-2S型恒温水浴箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，EPICS-XL/XL-MCL型流式细胞仪(美国Beckmann公司)，SOPTOP型倒置显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)，1-1SPK型高速离心机(美国Sigma公司)，ES-315型压力蒸汽灭菌器(日本TOMY公司)，NDO-601SD型烘干箱(日本EYELA株式会社)，VS-840K-U型无菌紫外操作台(美国Thermo公司)，C2型激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司)。

1.2试药人乳腺癌细胞株 MCF-7和人宫颈癌细胞株Siha(中国科学院细胞库)。特级胎牛血清(FBS)(天津灏洋生物制品科技有限责任公司，批号TBD0110HYT)，Hoechst 33342染色液(北京Solarbio，批号C0031)，二甲基亚砜( DMSO)(天津市富宇精细化工有限公司，批号7235950)，BD-Pharmingen 556547 Annexin V PE细胞凋亡试剂盒(美国BD Biosciences公司，批号559763)，碘化丙啶/核糖核酸酶染色溶液(美国BD Biosciences公司，批号8019561)，Combretastatin A-4阳性药(上海源叶生物科技有限公司，批号CA0815QB14)，化合物I((E)-3-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)甲酸，C22H20O8),见图1。

图1CA-4及化合物I结构图

2 方法与结果

2.1方法

2.1.1 细胞培养 取MCF-7 接种于10%胎牛血清+1%双抗+1%谷氨酰胺的MEM培养基，取SiHa接种于10%胎牛血清+1%双抗+1%谷氨酰胺的DMEM高糖培养基，环境为37℃、5%CO2，2～3 d换液、传代1次。

2.1.2 细胞生长曲线 分别将MCF-7和SiHa细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，每组6个复孔设置8组(每组代表1 d)。每天加入1组MTT测定吸光度值(OD),连续测定8 d，以每天的平均OD值为纵轴，天数为横轴，绘制细胞生长曲线。

2.1.3 细胞形态学 将MCF-7和SiHa细胞以1×105个/mL的密度均匀接种于激光共聚焦专用玻璃皿，用化合物I(1、5、15 μmol/L)及5 μmol/L CA-4处理细胞24 h后，按照Hoechst 33342染色液(1 mg/mL)使用说明加入1 mL染色液，37℃、5%CO2孵育30 min，弃染色液，用PBS洗涤1次，在激光共聚焦下观察细胞形态变化并拍照。

2.1.4 MTT实验 分别将MCF-7和SiHa细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板，每孔加100 μL，置于37℃、5%CO2恒温箱24 h。药物组每孔加入100 μL浓度分别为0.1、1.0、5.0、15.0、50.0、100.0 μmol/L的药液、阴性对照组只加细胞液、阳性对照组为系列浓度的CA-4、空白对照只加培养液，各浓度组均设6个复孔。置于37℃、5%CO2环境培养48 h后，吸掉孔内液体，加入现配含5 mg/mL 10%的MTT培养液100 μL，孵育4 h后，弃孔内液体，加入150 μLDMSO，振荡30 s，待紫色结晶物完全溶解，用酶标仪测定570 nm处OD值，计算化合物对细胞生长增殖的抑制率。细胞生长抑制率%=[1-(药物处理组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)]×100% 。

2.1.5 细胞凋亡实验 将MCF-7和SiHa细胞分别以1×105个/mL均匀接种于6孔板，用化合物I(0.1、1.0、5.0 μmol/L)处理细胞48 h。收集细胞，并重悬于100 μL的Bingding Buffer中。而后向细胞中加入FITC Annexin V和PI各5 μL，室温下避光15 min后补加400 μL Bingding Buffer，用滤网过滤到流式管后上机检测。

2.1.6 细胞周期实验 将MCF-7和SiHa细胞以3×105个/mL均匀接种于6孔板，用化合物I(0.1、1.0、5.0、15.0 μmol/L)处理细胞48 h。收集细胞，加入预冷的75%乙醇，-20℃固定过夜，加入PI/RNase Staining Buffer 400 μL室温下避光30 min，用滤网过滤入流式管后上机检测。

2.1.7 分子对接 使用PyMoL 1.7.6软件提取PI3K蛋白与3K6复合物的A链，含1单元的PI3Kα蛋白和1分子3K6配体结构。使用AutodockTools 1.5.6软件删除水分子、添加极性氢和电荷，转化为PDBQT格式。然后用ChemBioDraw Ultra 14.0软件画出小分子12的结构，用ChemBio3D Ultra 14.0软件转化为三维结构，并使用MMFF94力场进行能量优化，最后用AutodockTools 1.5.6转化为PDBQT格式用于分子对接。

2.2结果

2.2.1 细胞生长曲线 SiHa细胞培养第1天与第2天相比，OD值升高，差异有统计学意义(P<0.05),其在第1天进入对数生长期；MCF-7细胞在生长的第2天与第3天比较，OD值升高，差异有统计学意义(P<0.05),其在第2天进入对数生长期，见表1。

表1 SiHa及MCF-7生长OD值

2.2.2 化合物I对SiHa及MCF-7细胞形态学影响 与阴性对照组相比，加药后MCF-7及Siha细胞荧光强度增加，细胞数量下降，并出现核破裂、浓缩等细胞凋亡表现，随着药浓度的增加，SiHa 及MCF-7细胞的凋亡现象更加明显，见图2。

2.2.3 化合物对SiHa及MCF-7细胞增殖的影响 化合物I对MCF-7和SiHa 2种肿瘤细胞有良好的抗增殖活性，且随着化合物浓度的增加，细胞增殖抑制率总体呈上升趋势。化合物I对SiHa细胞的IC50值为1.10 μmol/L，强于阳性对照药CA-4；化合物I对MCF-7细胞的IC50值为0.89 μmol/L，与阳性对照药CA-4相当，见表2、3。

SiHa(0 μmol/L)

化合物I(1 μmol/L)

化合物I(5 μmol/L)

化合物I(15 μmol/L)

CA-4(5 μmol/L)

MCF-7(0 μmol/L)

化合物I(1 μmol/L)

化合物I(5 μmol/L)

化合物I(15 μmol/L)

CA-4(5 μmol/L)

图2 化合物I对SiHa及MCF-7细胞形态学影响

注：与阴性对照组比较，*P<0.05。

表3 化合物I和CA-4体外抗SiHa和MCF-7细胞的IC50值

2.2.4 细胞生长周期结果 与阴性对照组相比，给药后,化合物I的浓度从0.1 μmol/L增加到15.0 μmol/L，SiHa细胞在G2期占比从15.42%增加到89.77%，MCF-7细胞在G2期占比从15.06%增加到64.12%，并且呈浓度依赖型。当以15.0 μmol/L浓度给药CA-4时，得到SiHa细胞在G2期占比为83.37%,MCF-7细胞在G2期占比为65.92%，见图3、表4。

SiHa(0 μmol/L)

化合物I(0.1 μmol/L)

化合物I(1.0 μmol/L)

化合物I(5.0 μmol/L)

化合物I(15.0 μmol/L)

CA-4(15.0 μmol/L)

MCF-7(0 μmol/L)

化合物I(0.1 μmol/L)

化合物I(1.0 μmol/L)

化合物I(5.0 μmol/L

化合物I(15.0 μmol/L)

CA-4(15.0 μmol/L)

图3 不同浓度化合物I和CA-4作用48 h后SiHa和MCF-7细胞周期实验结果图

2.2.5 细胞凋亡结果 Q1表示细胞株中机械损伤细胞，Q2表示晚期凋亡细胞，Q3表示细胞株中的正常细胞，Q4表示早期调亡细胞，Q2+Q4为总凋亡。与阴性对照组相比，给药后，当化合物I的浓度从0.1 μmol/L增加到5.0 μmol/L时，SiHa细胞总凋亡率从14.30%增加到71.70%，MCF-7细胞总凋亡率从19.40%增加到59.20%，并且呈浓度依赖型。当以1.0 μmol/L浓度给药CA-4时SiHa细胞总凋亡率为51.30%；MCF-7细胞总凋亡率为36.70%。化合物I具有强烈的诱导细胞凋亡作用，随着给药浓度的增加，细胞早晚期总凋亡比例升高，且对SiHa细胞的促凋亡作用更强，见图4、表5。

表5 化合物I及CA-4对 SiHa 和 MCF-7细胞促凋亡作用结果

SiHa(0 μmol/L)

化合物I(0.1 μmol/L)

化合物I(1.0 μmol/L)

化合物I(5.0 μmol/L)

CA-4(5.0 μmol/L)

MCF-7(0 μmol/L)

化合物I(0.1 μmol/L)

化合物I(1.0 μmol/L)

化合物I(5.0 μmol/L)

CA-4(5.0 μmol/L)

图4化合物I及CA-4对SiHa和MCF-7细胞的凋亡作用图

2.2.6 分子对接结果 采用AutoDock Vina 1.1.2程序将晶体结构中的3K6配体和PI3Kα蛋白进行了重对接研究。重对接得到3K6和PI3Kα蛋白结合的最低能量为-9.8 kcal/mol，化合物I的最低结合能为-8.0 kcal/mol，显示化合物I和PI3Kα蛋白可以较好的嵌合，但是结合强度弱于3K6配体。在结合自由能分析中得到化合物I和蛋白之间具有较强的结合力，3,4,5-三甲氧基苯基可以与氨基酸残基Trp-780形成CH-π相互作用，而化合物I的苯并呋喃环骨架位于另一个由氨基酸残基Met-800、Ile-848和Ile-932所形成的疏水性腔袋，形成稳定的疏水性相互作用，再者化合物I的羰基氧和羧基氧可以分别和氨基酸残基Ser-854和Asp-933形成双重氢键，氢键距离为2.6Å(强键)和3.4Å(弱键)。这些氢键作用使小分子I和PI3Kα蛋白结合成稳定复合物的主要亲和力，见图5～8。

图5 化合物I的平面(A)和立体(B)结构图

图6基于3K6确定的对接口袋绿色卡通模型为4WAF中的A链的PI3Kα蛋白结构图

图7化合物I和3K6结合位点的结合模式图

图8化合物I在3K6结合位点与PI3Kα蛋白的结合模式图

3 讨论

化合物I含有多个亲水基团可以形成氢键，增加了水溶性，活性较好，对于MCF-7细胞，化合物I的抗增殖作用与阳性对照药物CA-4相当；对于SiHa细胞，化合物I的作用强于对照药物CA-4。分子对接表明化合物12可与PI3K形成稳定复合物。

化合物I对MCF-7及SiHa细胞具有较好的抗增殖活性，是治疗癌症的潜在分子目标，与阳性对照组相比，无论从凋亡还是周期上均显示出其活性优势，且分子对接研究从分子水平对化合物I与PI3Kα蛋白的结合模式给予了合理的解释，为进一步研究新型PI3K蛋白抑制剂奠定了理论基础，也为研究PI3K通路[17]提供了思路，后期将对其进一步研究探索。