多发性骨髓瘤患者Treg细胞、Th17细胞及相关转录因子mRNA的表达及临床意义

邹 健， 孙丽华， 范小红， 孟亚红， 王雪莲， 化范例， 程韵枫

复旦大学附属中山医院青浦分院血液科，上海 201700

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种恶性浆细胞病，多见于中老年人群。近年来，随着人口老龄化，每年新增病例呈逐年上升趋势[1]。MM患者存在免疫系统的多种缺陷，且患者的免疫功能缺陷是该病的一个重要特征并影响其疾病进展。MM患者T细胞的数量和功能都存在异常[2]。较早期的研究[3-4]已显示，MM患者CD4/CD8细胞比值降低，与疾病进展相关。

调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞(Thl7)是重要CD4+T细胞亚群，在多种疾病中发挥重要作用[5]。其中，Treg细胞可抑制抗肿瘤的免疫反应，特异性的转录因子为Foxp3；Th17细胞在肿瘤免疫中的作用仍有争议[2,6]，特异性转录因子为维甲酸相关孤儿核受体γt (retinoic acid-related orphan receptor γt，RORγt )。这两种细胞在分化发育中相互制衡，两者平衡在维持免疫稳定及抗肿瘤免疫中发挥重要的作用。本研究通过检测MM患者不同时期外周血及骨髓中Treg细胞和Thl7细胞的比例及其特异性转录因子mRNA的表达水平，分析Treg细胞、Thl7细胞在MM各期的变化，及其与C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)的关系，进而进一步分析Treg、Th17平衡在MM发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2015年6月至2017年11月收治的MM患者46例，诊断均符合2011年中华医学会制定的《中国多发性骨髓瘤诊治指南》[7]中的标准。46例患者中，男性26例、女性20例，年龄45～78岁，中位年龄59岁。初发20例、平台期16例、复发10例；ISS分期Ⅰ期10例、Ⅱ期16例、Ⅲ期20例；免疫分型IgG型23例、IgA型11 例、轻链型7例、其他5例。本研究经医院伦理委员会审核批准，患者知情同意并签署知情同意书。

按照《中国多发性骨髓瘤诊治指南》[7]，20例初发患者接受硼替佐米为基础的化疗方案；10例复发患者中，复发前接受硼替佐米(n=8)或沙利度胺(n=2)为基础的方案，复发后接受硼替佐米(n=7)或来那度胺为基础的方案(n=3)。另选择行骨髓检查的健康者20例为对照组，其中男性11例、女性9例，年龄40～70岁，中位年龄55岁，均排除近期感染、肿瘤、自身免疫性疾病或传染性疾病。

1.2 外周血单个核细胞(PBMCs)采集 每例对象无菌抽取静脉血5 mL，置于EDTA抗凝管中，用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获取PBMCs：取MM患者或健康志愿者外周静脉血5 mL，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝；15 mL离心管中加入3 mL Ficoll液，同时将外周血以2倍HBSS稀释，加至Ficoll液面之上，1 000×g离心15 min；吸取PBMCs层，以10 mL HBSS洗涤2次(300×g离心10 min)后，置于1 mL含有10%DMSO的新生牛血清中-80℃过夜，液氮中保存，待测。骨髓血(2 mL)单个核细胞采集法同上。

1.3 流式细胞术检测Treg细胞及Th17细胞数

1.3.1 Treg细胞 调整上述采集的细胞浓度为1×106/100 μL，加入20 μL CD4 PE-Cy5/CD25 PE抗体(BD Biosciences, 批号：555348/562525)，混匀后室温、暗室孵育20 min，细胞染色缓冲液洗涤1次后以250×g离心5 min，弃上清；加入1 mL Foxp3破膜固定缓冲液，混匀后室温、暗室孵育20 min，以250×g离心5 min，弃上清；细胞染色缓冲液洗1次，1 mL FOXP3破膜缓冲液洗涤2次，250×g离心5 min，弃上清；100 μL FOXP3破膜缓冲液重悬细胞，加入5 μL Alexa Fluor○R488 FOXP3抗体(BD Biosciences, 批号：560047)或5μL Alexa Fluor○R488小鼠IgG1 k同型对照(BD Biosciences, 批号：557721)，室温、暗室孵育30 min；细胞染色缓冲液洗涤2次，以0.5 mL细胞染色缓冲液重悬，上流式细胞仪检测。

1.3.2 Th17细胞 调整上述采集的细胞浓度为(0.5～1)×106/100 μL，加入0.5 mL固定缓冲液，混匀后室温、暗室孵育20 min，以350×g离心5 min，弃上清；加入2 mL破膜缓冲液，混匀后室温、暗室孵育20 min，以350×g离心5 min，弃上清，重复1次。100 μL破膜缓冲液重悬细胞，加入20 μL Alexa Fluor○R647小鼠IgG1 k同型对照/CD3-FITC/CD4-PE抗体(BD Biosciences, 批号：555339/562281)或IL-17 Alexa Fluor○R647/CD3-FITC/CD4-PE抗体，室温、暗室孵育30 min，2 mL破膜缓冲液洗涤2次，0.5 mL细胞染色缓冲液重悬，上流式细胞仪检测。

1.4 RT-PCR检测转录因子Foxp3及RORγt mRNA

的表达水平 PBMCs于37℃水浴复苏后，HBSS洗涤，取(1～2)×106个细胞，加入1 mL Trizol，按照说明书提取总RNA。检测RNA纯度及浓度，取1 μg RNA的液体量，配制反转录反应液，37℃ 15 min、85℃ 5 s，逆转录cDNA。取cDNA 1 μL，配制qRT-PCR反应液，反应体系为20 μL。反应条件：95℃预变性30 s，95℃扩增5s，60℃延伸30 s；共40个循环。以GAPDH作为内参，记录Ct值，计算相对RNA含量。

2 结 果

2.1 各组外周血Treg细胞、Th17细胞比率及Treg/Th17比值比较 结果(表1)表明：初发组及复发/难治组Treg细胞比率较正常对照组及平台期组升高(P<0.05)，Th17细胞比率无明显改变；初发组与复发/难治组间Treg细胞、Th17细胞比率差异均无统计学意义。初发组及复发/难治组Treg/Thl7比值较正常对照组及平台期组升高(P<0.05)。

2.2 各组骨髓Treg细胞、Th17细胞比率及Treg/Th17比值比较 结果(表2)表明：初发组及复发/难治组Treg细胞比率较正常对照组及平台期组升高(P<0.05)，Th17细胞比率无明显改变；初发组与复发/难治组间Treg细胞、Th17细胞比率差异均无统计学意义。初发组及复发/难治组Treg/Th17比值较平台期组及正常对照组Treg/Th17比值升高(P<0.05)。

表1 各组外周血Treg细胞、Th17细胞比率及Treg/Thl7比值比较

*P<0.05与正常对照组相比；△P<0.05与平台期组相比

表2 各组骨髓Treg细胞、Th17细胞比率及Treg/Thl7比值比较

*P<0.05与正常对照组相比；△P<0.05与平台期组相比

2.3 各组外周血及骨髓中转录因子Foxp3 mRNA、RORγt mRNA表达水平 结果(表3)表明：外周血及骨髓中，初发组及复发/难治组患者Foxp3较平台期组和正常对照组升高(P<0.05)；初发组及复发/难治组RORγt mRNA略高于平台期组及正常对照组，但差异无统计学意义。

2.4 血清IL-6、CRP水平与Treg/Th17比值的相关性 结果(表4)表明：初发组及复发/难治组血清IL-6、CRP水平较平台期组和正常对照组升高(P<0.05)，与外周血及骨髓Treg/Th17比值变化趋势一致。

表3 各组外周血及骨髓中Foxp3 mRNA、RORγt mRNA表达水平的比较

*P<0.05与正常对照组相比；△P<0.05与平台期组相比

表4 各组血清IL-6、CRP水平比较

*P<0.05与正常对照组相比；△P<0.05与平台期组相比

3 讨 论

MM是高度异质性疾病，存在复杂的免疫系统缺陷。骨髓瘤细胞来源于B细胞发育终端的浆细胞，患者免疫系统存在多种异常，其中细胞免疫异常(如B细胞减少、CD4/CD8细胞减少)与患者生存时间负相关，提示细胞免疫在疾病控制中发挥重要作用[2]。

Treg细胞与Th17细胞在细胞分化和功能上存在相互制衡、互相转化的关系；在肿瘤患者体内，Treg/Th17细胞平衡向Treg倾斜。在MM患者中，Treg细胞增多，其一方面由恶性浆细胞释放的多种细胞因子诱导产生[8]，一方面来自于细胞间抗原传递(Trogocytosis现象)[9]。在MM患者中，Trogocytosis现象较为常见，即恶性浆细胞将细胞表面抗原传递给T细胞，产生新的T细胞表面免疫表型，由此诱导新的Treg细胞产生[10-11]。本研究发现，初发MM和难治复发患者的外周血和骨髓中，Treg细胞比率均升高，与颜斌等[12]的结果相似。但也有研究[13]报道，Treg细胞比率在MM初发、复发时明显降低，原因可能与患者接受的治疗方案相关[14]。

关于MM患者中Th17细胞比率的研究结论并不一致。研究[15]报道，MM患者骨髓中Th17细胞增多；也有研究[16]发现，MM患者中Th17细胞较正常对照无明显改变，本研究结果与之相似。

Foxp3是Treg细胞的转录因子。本研究MM患者中，Foxp3呈现与Treg细胞数量相同的变化趋势，从转录水平证实Treg细胞在MM患者初发、复发时增加，治疗有效后恢复正常水平；Th17细胞关键性转录因子RORγt在各期MM患者中无显著变化，与Th17细胞数量水平变化趋势一致，从转录水平证实Th17细胞在MM患者中无明显变化。

Treg与Th17在自身免疫中发挥相反的作用，但分化密切相关：CD4+T幼稚细胞在转化生长因子-β(TGF-β)诱导下表达Foxp3或RORγt，分别诱导CD4+T向Treg和Th17细胞双向分化。CD4+T细胞由所在环境中的细胞因子决定其分化方向，例如：在前炎症因子和低浓度TGF-β存在时，RORγt表达上调、Foxp3表达受到抑制，使细胞具有Th17特性；高浓度TGF-β则有助于Foxp3表达，使细胞具有Treg特性。因此，Treg/Th17比值可以反映细胞免疫异常情况。本研究发现，Treg/Th17细胞比值与MM病情相关，新诊断、病情复发时升高，有效控制病情后恢复正常水平， 提示Treg/Th17比值与MM预后相关。研究证实，Treg/Th17比值升高的患者预后不良[17]；长期存活患者的Treg/Th17比值正常甚至低于正常[18]。因此，Treg/Th17比值较Treg和Th17细胞比率更具有MM预后价值[9]。

IL-6是MM细胞重要的生长因子，其相关信号通路可调控MM细胞的增殖、程序性死亡[19]。MM患者IL-6升高与预后不良、生存时间短密切相关[20]。本研究发现，初发组、复发/难治组IL-6水平高于平台期组和正常对照组，与既往文献[20]报道符合。IL-6是Th17细胞分化中重要的诱导炎症因子，即在IL-6存在下，Treg/Th17平衡向Th17倾斜。但本研究中，Th17细胞数量没有明显改变，且Treg/Th17平衡向Treg倾斜。出现这种结果的原因可能为：首先，本研究检测的是外周血血清IL-6水平，不能准确反映MM肿瘤微环境的情况，骨髓中可能存在其他影响Th17分化的因素；其次，MM患者Treg细胞升高更为明显。

CRP是急性相蛋白，在IL-6刺激下由肝细胞合成。研究[21-22]表明，CRP水平能反映IL-6相关信号通路的活性。本课题组前期研究[21]发现，CRP升高水平与MM患者疗效差相关；本研究显示，CRP水平与Treg/Th17比值变化趋势一致，进一步说明CRP可用于预测MM预后。

综上所述，本研究通过对MM各期患者外周血及骨髓中Treg、Th17细胞比率，以及患者外周血血清IL-6和CRP水平的分析，证实Treg/Th17平衡在MM活动期向Treg细胞倾斜，有效治疗后恢复，提示Treg/Th17比值具有MM预后判断作用。此外，本研究中，经过治疗后，部分患者Treg/Th17比值仍较高，可能与治疗效果不佳相关。在MM患者中，Treg/Th17平衡是否受到其他细胞亚群或因子的影响，有待于更深入的研究来明确。