急性冷胁迫对中华鳖幼鳖肠道黏膜组织的影响

邢 潇 宋如昕 王 兰 牛翠娟 张左兵

(1. 山西大学生命科学学院, 太原 030006; 2. 北京师范大学生命科学学院, 北京 100875)

中华鳖(Pelodiscus sinensis)属于脊索动物门、脊索动物亚门、爬行纲、无孔亚纲、龟鳖目、曲颈龟亚目、鳖科。中华鳖是一种外温动物, 水陆两栖, 在我国广泛分布(除青海、西藏、新疆地区), 其中以长江流域和华南地区较为多见, 国外主要分布于朝鲜、日本和越南等地[1]。由于中华鳖具有极高的营养价值、经济价值和科研价值[2], 其养殖逐步形成了适度规模化的地方优势特色产业, 但随着该产业的快速发展, 疾病已成为制约其健康可持续发展的重要因素。

在中华鳖大规模分布的区域, 经常会出现气温骤然变化的情况, 且多发生于5月和10月。这种气温骤然变冷会造成养殖中华鳖出现“感冒”症状, 并呈暴发性死亡, 给中华鳖养殖产业带来重大损失。但目前尚不清楚, 病原是如何造成这种死亡的。肠道是机体长期与外界直接接触的器官, 在正常的生理情况下肠道黏膜的多种屏障可以有效阻止肠腔内的病原体侵入机体, 但在应激状态下, 肠黏膜通透性增加, 肠腔内的病原体透过肠黏膜侵入机体,诱发炎症反应[3—5]。因此, 中华鳖肠道可能是病原入侵的潜在门户。肠道黏膜屏障主要是由机械屏障、化学屏障、免疫和生物屏障构成。其中机械屏障属于机体第一道防线。该防线由肠黏膜表面的黏液层、黏膜上皮细胞和细胞间紧密连接构成,能有效阻止细菌透过黏膜进入组织[6—8]。因此, 维持正常的肠道黏膜机械屏障的功能对保证动物肠道生态系统的稳定性具有重要意义。

监测肠道黏膜机械屏障功能是判断肠道黏膜屏障完整性的的重要依据之一, 但目前很难直接观察肠道黏膜机械屏障的功能, 多通过间接的方法进行检测。临床上常用以下几种方法进行检测: 肠黏膜通透性测定、血浆内毒素检测、肠黏膜pH测定及二胺氧化酶测定。二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)是主要存在于小肠的黏膜或纤毛上皮细胞中催化二胺的细胞内酶, 小肠黏膜屏障功能衰竭时或肠黏膜细胞坏死时血清DAO活性升高[9,10]。因此,血液中的DAO活性能够很好的反映肠道损伤状态。

DAO活性和肠道黏膜组织结构是反应肠道黏膜机械屏障结构和功能的完整性的重要指标。应激反应会造成大鼠肠道黏膜受损, 光镜观察发现应激会造成大鼠肠黏膜绒毛肿胀变短, 顶端脱落并伴有炎性渗出物, 电镜观察亦可见绒毛倒伏、脱落,形态结构不清等类似现象, 呈现时间依赖性[11]。并伴随着血清二胺氧化酶DAO浓度的显著升高。

鉴于此, 本文以中华鳖幼鳖为动物模型, 系统的探讨冷胁迫对DAO活性、肠道黏膜组织形态的影响, 初步探讨了急性冷胁迫对肠道黏膜组织学特征的影响, 旨在为经常遭受急性冷胁迫的中华鳖正常生理机能维持提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与驯养

健康中华鳖幼鳖购自河北省玉田县中华鳖良种场。急性冷胁迫实验先后进行了2次, 其中第一次急性冷胁迫实验用32只, 体重(116.5±25.30) g; 急性冷胁迫及复温实验用45只, 体重(128.4±15.72) g。实验前适应性喂养2周, 养殖期间每日投喂商品化饲料并换水, 水温维持在(25±1)℃。降温前12h, 对照组和实验组动物均开始禁食, 直至实验结束。

1.2 实验方法

动物分组和组织标本取材实验分为两部分。第一部分为第一次急性冷胁迫实验: 驯化后的中华鳖随机分为4组, 每组8只。分别在冷胁迫开始后的0、6h、24h和48h取血, 其中0组为对照组。

第二部分为急性冷胁迫及复温实验: 驯化后的中华鳖随机分成5组, 每组9只。其中冷胁迫前25℃对照组为C0组, 冷胁迫3d 25℃对照组为C3d组, 冷胁迫3d 15℃组为T3d组, 冷胁迫11d 25℃对照组为C11d组, 15℃冷胁迫8d后迅速升温至25℃并维持3d为T8d+3d组, 其中温度维持在25℃的组别为对照组。在断头法处死中华鳖后, 取血。迅速开腹, 于回肠后端和大肠处取0.5 cm肠段置于4%中性多聚甲醛中固定, 以备PAS染色观察病理变化。

在实验过程中, 使用冷水机将水温从25℃迅速降至15℃, 各组中华鳖于各相应时间点进行标本取材。

血清DAO活性检测用断头法取血2 mL,37℃放置1h后, 4℃过夜, 3000 r/min于4℃离心10min, 取上层血清置于-80℃冰箱保存待测。用活性比色法测定DAO (南京建成生物工程研究所)的活性。

肠黏膜的病理学观察组织标本取材经4%多聚甲醛固定, 常规脱水、透明、浸蜡、包埋,制成3 μm厚切片。将切片依次浸入二甲苯10min,二甲苯10min, 无水乙醇, 95%乙醇, 75%乙醇, 蒸馏水各5min, 0.5%高碘酸10min, 流水冲洗2min,Schiff氏液避光染色40min, 流水冲洗5min, 苏木精染色3min, 流水冲洗5min, 1%盐酸酒精分色1s, 酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片, 光镜观察。图像分析采用ImageJ2x专业图像分析软件(Broken Symmetry Software公司)。每个肠管取5张切片, 每张切片选取5个最长肠绒毛的长度、最深隐窝深度和最厚黏膜厚度以及单位面积内杯状细胞数目进行测量。

统计学分析数据以均数±标准差(Mean±SD)表示, 应用SPSS 17.0统计软件, 多组间样本比较采用单因素方差分析, 两组间样本比较采用最小显著差异t检验(LSD-t), 对各组均数进行显著性检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清DAO活性

第一次急性冷胁迫对中华鳖血清DAO活性的影响由图 1可知, 中华鳖血清DAO活性随急性冷胁迫时间的增加而呈现降低趋势。急性冷胁迫48h组的血清DAO活性显著低于对照组(P=0.0289),急性冷胁迫6h组的血清DAO活性显著高于急性冷胁迫48h组(P=0.0315), 急性冷胁迫24h组的血清DAO活性极显著高于急性冷胁迫48h组(P=0.0081)。

急性冷胁迫及复温对中华鳖血清DAO的影响

急性冷胁迫3d组T3d的血清DAO活性显著低于其他各组(图 2)。急性冷胁迫前对照组C0的DAO活性显著高于冷胁迫3d组T3d(P=0.049), 急性冷胁迫3d对照组C3d的DAO活性极显著高于急性冷胁迫3d组T3d(P=0.0044), 急性冷胁迫11d对照组C11d和冷胁迫8d后迅速升温至25℃并维持3d组T8d+3d的DAO活性均显著高于冷胁迫3d组T3d(P=0.0381)。

2.2 肠道黏膜病理学观察

肠道黏膜上皮的形态学变化光镜下观察发现, 急性冷胁迫后各组中华鳖的肠黏膜结构完整,层次分明, 肠黏膜上皮细胞的轮廓清晰, 染色鲜明,排列规则, 杯状细胞清晰(图 3、图 4)。肠黏膜表面的纹状缘结构整齐均匀。固有层结构清晰, 上皮细胞呈正常生长更新状态。急性冷胁迫后, 中华鳖回肠后段和大肠的黏膜形态并未发生明显变化。

图 1 第一次急性冷胁迫后中华鳖血清DAO活性Fig. 1 The DAO activity of Chinese soft-shelled turtle during the first acute cold stress experiment

图 2 急性冷胁迫及复温实验中各组中华鳖血清DAO活性Fig. 2 The DAO activity of Chinese soft-shelled turtle in acute cold stress and rewarming experiments

回肠后段和大肠杯状细胞数目变化通过ImageJ2x软件计算单位面积/像素内杯状细胞的数目可得表 1和图 5 , 可知: 在急性冷胁迫后, 各组中华鳖回肠后段杯状细胞数与对照组相比没有显著变化(P=0.098), 急性冷胁迫3d组杯状细胞数目显著低于急性冷胁迫3d对照组大肠的杯状细胞数目(P＜0.001)。

中华鳖回肠后段绒毛长度、肠壁厚度/大肠肠壁厚度变化急性冷胁迫对中华鳖回肠后段绒毛长度、黏膜厚度和大肠黏膜厚度的影响见表 2和图 6—8。由图 4可知, 大肠由于没有肠绒毛, 因此不对其绒毛长度进行统计。由表 2 和图 6可知, 急性冷胁迫3d组的回肠后段绒毛长度要低于急性冷胁迫3d对照组, 但总体来说没有显著影响(P=0.077)。由图 7可知: 中华鳖回肠后段急性冷胁迫3d组黏膜厚度显著低于急性冷胁迫3d对照组(P=0.0015), 中华鳖回肠后段急性冷胁迫8d后迅速升温至25℃并维持3d组黏膜厚度显著高于急性冷胁迫11d对照组(P=0.009); 急性冷胁迫对中华鳖大肠黏膜厚度没有显著影响(P=0.3626)。由图 8可知: 急性冷胁迫对中华鳖回肠后段绒毛长度和隐窝深度的比值没有显著影响(P=0.079)。

3 讨论

3.1 急性冷胁迫引起的肠道黏膜屏障组织化学损伤

研究表明: 胁迫可引起肠黏膜屏障通透性升高, 导致胃肠功能紊乱和病变。DAO可通过调节细胞内的离子平衡、影响传导通路、促进细胞修复,对肠黏膜具有保护作用[12]。DAO最初在小肠黏膜绒毛上皮细胞中被发现, 主要分布在小肠黏膜绒毛上皮细胞中, 占95%, 少量分布在胎盘和肾脏, 其他组织和细胞中含量较少[13]。正常机体血清DAO活性很低, 当肠黏膜损受伤时, 导致血清DAO活性增高[14]。DAO酶活的变化是研究创伤后肠屏障功能损伤的理想指标, 尤其是血清中DAO酶活变化[15],因此血清DAO活性是反映肠黏膜损受的理想指标。本实验结果显示: 无论是在第一次急性冷胁迫实验, 还是急性冷胁迫及复温实验中, 急性冷胁迫均会使中华鳖血清DAO活性显著低于各对照组, 且随着温度的恢复, 血清DAO的活性也显著升高, 这与黎友军等[16]的研究结果相反。在本研究中, DAO活性的降低会随温度的升高而恢复。由于DAO主要分布在小肠黏膜绒毛上皮细胞中, 这提示我们急性冷胁迫未造成小肠黏膜屏障功能破坏。另一个可能原因是, 低温造成DAO在小肠合成减少, 在小肠屏障功能没有受到破坏的情况下, 进入血清DAO减少。

图 3 急性冷胁迫对中华鳖回肠后段黏膜上皮组织形态影响的显微照片(PAS染色×400)Fig. 3 Micrograph of acute cold stress on the mucosal epithelial tissue morphology of the posterior ileum of Chinese soft-shelled turtle (PAS staining×400)

F. 冷胁迫前对照组; G. 冷胁迫3d对照组; H. 冷胁迫3d组; I. 冷胁迫11d对照组; J. 冷胁迫8d后迅速升温至25℃并维持3d组; 箭头所指为杯状细胞F. control group before cold stress; G. control group at day 3 after acute cold stress; H. cold stress group at day 3 day; I. control group at day 11 after acute cold stress; J. cold stress group at day 8 and maintained at 25℃ for 3 days. The arrows refer to goblet cells

表 1 急性冷胁迫对中华鳖回肠后段/大肠杯状细胞数的影响Tab. 1 Effects of acute cold stress on the number of goblet cells in the posterior segment of ileum/the large intestine in Pelodiscus sinensis

图 5 急性冷胁迫及复温实验中回肠后段/大肠杯状细胞数目变化Fig. 5 The number of goblet cells in the posterior segment of ileum/the large intestine in acute cold stress and rewarming experiments

肠道黏膜上皮杯状细胞分泌的黏液在黏膜表面形成疏水的黏液凝胶层, 主要成分是黏液糖蛋白,它覆盖肠上皮表面, 可阻抑消化道中的消化酶和有害物质对上皮细胞的损害[17]。有研究表明: 应激会使猪黏液IgA蛋白的表达发生紊乱[18]。黏液层的不断更新和维持对于机体肠道屏障十分重要, 黏液层的维持主要由部分肠杯状细胞中的单个细胞定期进行基础分泌完成[19]。因此, 肠道上皮中的杯状细胞的数目在一定程度上可以间接反映黏液层的状况, 对于判断机体肠道黏膜屏障的完整性具有重要意义。在本实验中: 在急性冷胁迫后, 中华鳖各组回肠后段杯状细胞数目没有显著变化, 急性冷胁迫3d组杯状细胞数目显著低于急性冷胁迫3d对照组大肠的杯状细胞数目, 提示急性冷胁迫可能会使中华鳖大肠黏液层稳定性发生改变, 从而破坏大肠黏膜机械屏障。

表 2 急性冷胁迫及复温对中华鳖回肠后段绒毛长度、肠壁厚度、大肠肠壁厚度及绒毛长度隐窝深度的影响Tab. 2 Effects of acute cold stress and rewarming on villus length, intestinal wall thickness in the posterior segment of ileum, intestinal wall thickness in the large intestine and the villi length/crypt depth of Chinese soft-shelled turtle

图 6 急性冷胁迫及复温实验中回肠后段肠绒毛高度变化Fig. 6 Intestinal villus height in the posterior segment of ileum during acute cold stress and rewarming experiments

图 7 急性冷胁迫及复温实验中回肠后段/大肠黏膜厚度变化Fig. 7 Changes of colorectal mucosa in the posterior segment of ileum/large intestine during acute cold stress and rewarming experiment

3.2 急性冷胁迫引起的肠道黏膜组织形态损伤

图 8 急性冷胁迫及复温实验中回肠后段绒毛长度/隐窝深度(V/C)变化Fig. 8 Ratios of villus length/crypt depth (V/C) in posterior segment of ileum during acute cold stress and rewarming experiment

有研究表明胁迫会引起肠道黏膜上皮结构发生改变。如虹鳟(Oncorhynchus mykiss)在急性胁迫后, 肠道紧密连接减少, 肠道上皮通透性增加[20]; 山齿鹑(Colinus virginianus)在冷胁迫后, 观察到肠道上皮发生损伤[21]。胁迫引起的糖皮质素释放因子、P物质等神经肽能够造成小鼠肠道黏膜通透性增加, 会使增加病原菌入侵的机会[22,23]。张雯等[24]通过光镜对雏鸡(Gallus gallus)肠黏膜进行形态学观察, 发现急性、慢性冷应激均对肠黏膜的形态有显著的影响。他发现在冷胁迫后, 观察雏鸡空肠HE切片可见与对照组相比应激组绒毛高度明显降低, 出现绒毛断裂、稀疏, 肠黏膜充血、出血、白细胞浸润等现象。本实验结果显示, 通过光镜对肠黏膜进行形态学观察, 发现急性冷胁迫对中华鳖肠黏膜组织形态并无显著影响。观察回肠后段和大肠PAS染色切片可见, 回肠后段肠绒毛排列整齐,并未出现断裂和缺失等现象, 大肠肠黏膜结构完整。绒毛长度和隐窝深度反映了小肠的功能状态,比值下降, 表示黏膜受损, 消化吸收功能降低, 常伴有腹泻的发生, 动物生长发育受阻; 比值上升, 则黏膜改善, 消化吸收功能增强, 腹泻率降低, 生长发育加快, 应激反应会使绒毛长度和隐窝深度比值降低[25]。在本实验中冷胁迫3d后, 绒毛长度/隐窝深度的比值低于常温对照组, 但没有显著性变化。中华鳖回肠后段急性冷胁迫3d组黏膜厚度显著低于急性冷胁迫3d对照组, 中华鳖回肠后段急性冷胁迫8d后迅速升温至25℃并维持3d组黏膜厚度显著高于急性冷胁迫11d对照组, 提示冷胁迫可能会使中华鳖回肠后段黏膜受损, 而随着温度的恢复这种损伤也会恢复。

综上所述, 急性冷胁迫会改变中华鳖肠道黏膜机械屏障的结构, 但在不同的肠段, 这种改变是不同的, 急性冷胁迫会使大肠杯状细胞数目降低, 降低大肠的肠道黏膜机械屏障功能。急性冷胁迫使回肠后段黏膜厚度降低, 使其通透性降低或通透性不受影响, 反应在血浆(清)DAO活性降低。这提示,中华鳖肠道在相同的急性冷胁迫下, 不同段对急性冷胁迫具有各自特殊的应对方式。与此同时, 我们也认识到单从组织化学和形态学上, 不能全面的分析急性冷胁迫对中华鳖肠道黏膜机械屏障的影响,我们下一步还需要从分子和蛋白的角度进行研究。