左旋多巴原料药精制母液化学成分的研究

黄 艳， 赵小超， 李学坚*， 卢文杰， 苏彩珍， 柴 玲， 刘布鸣

（1.广西壮族自治区中医药研究院，广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁530022；2.广西中医药大学科学实验中心，广西 南宁530222；3.广西邦尔药业有限公司，广西 百色531599）

左旋多巴，即（-） -3-（3，4-基苯基） -L-丙氨酸，具有显著的抗帕金森综合症作用，收载于2015 年版《中国药典》［1］、 《欧洲药典》［2］等；生产工艺有化学合成法、植物提取法、微生物转化法及新兴的代谢转化法［3］；国内以植物提取法为主，生产原料以猫豆为主。欧洲药典记载的相关物质（杂质） 有（2 s） -2-amino-3-（2，4，5-trihydroxy phenyl）propionic acid、3-methoxy-l-tyrosine、3-methoxy-dl-tyrosine、D-dopa。从以猫豆为原料生产的左旋多巴原料药产品中可检出3-methoxy-l-tyrosine、3-methoxy-dl-tyrosine。在生产实践中，虽然产品质量达到《欧洲药典》 要求，但HPLC 图谱上仍会出现近10 个未知成分的杂质峰，有时欧洲市场会以某种杂质峰过高为由拒绝购买或重新议价。为了弄清这些未知的化学成分，课题组对左旋多巴原料药生产工艺的精制母液进行研究，从中分离出12个化合物，且所有化合物均为首次从该母液中获得。

1 材料

Bruker Dre-600 MHz 核磁共振仪（德国Bruker公司）；Waters2545-2767-2489 高压制备液相色谱仪（美国Waters 公司）；分析型液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Autospec Premier 776 质谱仪（美国Waters 公司）；XS205 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器）；HH-S 恒温水浴锅 （江苏金坛市医疗仪器厂）；ZWD-83-1 型电热熔点检测器（江苏沙头文教五金塑料厂）； DZF-6050 真空干燥箱、 DHG9 246 A 电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；KQ5200B 超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。柱色谱、薄层色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）。色谱仪用化学试剂为色谱纯， 其余为分析纯。

精制母液由广西邦尔药业有限公司提供，对应的左旋多巴原料药产品批号20160517。

2 提取与分离

精制母液用4%NaOH 水溶液调至pH 6.0，低温真空浓缩成稠膏，60 ℃真空干燥，得干膏5.28 kg，打粉，用95%乙醇回流提取3 次 （12、8、8 倍量），冷至室温，滤过，合并提取液，减压回收乙醇，干燥，得醇提膏250.81 g。醇提膏用1 500 mL蒸馏水混悬， 依次用1 000 mL 石油醚 （60 ～90 ℃）、1 000 mL 乙酸乙酯、1 000 mL 正丁醇各萃取2 次，合并萃取液，减压回收溶剂，干燥，得相应部位35.88、53.95、87.82 g。石油醚部位经硅胶柱（石油醚-乙酸乙酯100 ∶0 ～1 ∶1）、Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1 ∶1）、重结晶以及制备液相等分离得化合物1（62.95 mg）、2（46.94 mg）、3（100.21 mg）、4（32.83 mg）、5（18.11 mg）、6（62.28 mg）、7（49.92 mg）、8（68.32 mg）；乙酸乙酯部位经硅胶柱（氯仿-甲醇100 ∶0 ～1 ∶1）、Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1 ∶1）、制备液相等分离得化合物9（15.73 mg）；正丁醇部位经D101 型吸附树脂、G-25 凝胶柱（甲醇-水100 ∶0 ～4 ∶1）、制备液相分离纯化得化合物10（27.34 mg）、11（24.47 mg）、12（15.89 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：无色针状结晶（氯仿-甲醇），EIMS m／z：412［M］＋。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：5.35（1H，d，J ＝3.9 Hz，H-6），5.14（1H，q，J ＝24.6 Hz，H-22），5.03（1H，q，J ＝21.9 Hz，H-23），3.50（1H， s，-OH），1.02 （3H， s， H-21）， 0.99 （3H， s， H-19）， 0.85 （6H， s， H-26、H-27）， 0.82 （3H， s， H-29）， 0.69 （3H，s，H-18）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz） δ：37.3（C-1），31.9（C-2），71.8（C-3），42.3（C-4），140.7（C-5）， 121.7 （C-6）， 31.9 （C-7、 8），50.1（C-9），36.5 （C-10），21.2 （C-11），39.7（C-12），42.2（C-13），56.9 （C-14），24.3 （C-15），29.0（C-16），56.0（C-17），11.9（C-18），19.4 （C-19）， 40.5 （C-20）， 21.1 （C-21），138.3 （C-22）， 129.3 （C-23）， 51.3 （C-24），31.7（C-25），21.1（C-26），19.0（C-27），25.4（C-28），12.1（C-29）。以上数据与文献［4］ 基本一致，故鉴定为豆甾醇。

化合物2： 白色蜡状结晶， EI-MS m／z：256［M］＋。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：2.36（2H，t，J ＝7.5 Hz，H-2），1.63（2H，m，H-15），1.25（br，s），0.88（3H， t， J ＝7.0 Hz， CH3）；13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：180.3 （C-1），34.1（C-2）， 24.7 （C-3）， 29.1 ～29.7 （C-4 ～13），31.9（C-14），22.7（C-15），14.1（C-16）。以上数据与文献［5］ 基本一致，故鉴定为棕榈酸。

化合物3： 无色片状结晶 （石油醚-乙酸乙酯）， EI-MS m／z： 420 ［ M-H2O］＋。1H-NMR（CDCl3， 500 MHz） δ： 3.58 （2H， t， J ＝7.5 Hz，-CH2OH）， 1.53 （2H， m， H-2、 3）， 1.21（54H， m， CH2）， 0.84 （3H， t， J ＝5.0 Hz，CH3）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：62.7 （C-1），32.6（C-2），14.0（C-30），22.6 ～31.8（C-29～3）。以上数据与文献［6］ 基本一致，故鉴定为正三十烷醇。

化合物4：无色片状结晶（氯仿），EI-MS m／z：358［M］＋。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δ：4.21（1H，dq，J ＝4.5 Hz，H-1′b），4.16（1H， dq，J ＝5.5 Hz，H-1′a），3.93（1H，m，H-2′），3.68（2H，m，H-3′），2.36 （2H，t，J ＝8.1 Hz，H-2），1.63（2H，m，H-3），1.24 ～1.32（28H，m，H-4～17），0.86（3H，t，J ＝5.9 Hz，H-18）；13CNMR（CDCl3，125 MHz） δ：174.4 （C-1），14.0（C-18），70.3 （C-1′），65.2 （C-2′），63.3 （C-3′），22.7～34.2（C-17 ～2）。以上数据与与文献［7］ 基本一致， 故鉴定为十八酸-2， 3-二羟基丙酯。

化合物5： 无色针状结晶 （石油醚-乙酸乙酯），EI-MS m／z：458［M］＋。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：4.51（1H，d，J ＝10 Hz，H-22），5.33（1H， s， H-12）， 3.70 （2H， m， H-24）， 3.65（1H， m， H-3）， 1.24 （3H， s， H-23）， 1.14（3H， s， H-25）， 1.06 （3H， s， H-26）， 1.04（3H， s， H-27）， 0.96 （3H， s， H-28）， 0.94（3H，s，H-29），0.85（3H，s，H-30）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz） δ：38.1（C-1），25.8（C-2），80.2（C-3）， 42.3 （C-4）， 56.3 （C-5）， 19.1（C-6），33.4（C-7），39.0（C-8），48.2（C-9），36.1 （C-10）， 23.7 （C-11）， 122.4 （C-12），144.8 （C-13）， 42.4 （C-14）， 28.4 （C-15），26.5（C-16），37.0（C-17），45.3（C-18），46.8（C-19），30.0（C-20），42.4 （C-21），75.6 （C-22），23.6（C-23），64.6（C-24），16.3（C-25），17.1（C-26），25.8（C-27），28.7（C-28），33.5（C-29），21.2（C-30）。以上数据与文献［8］ 基本一致，故鉴定为soyasapogrnol B。

化合物6：无色针状结晶（氯仿-甲醇），进行溴甲酚绿反应呈阳性，即有羧基的存在。EI-MS m／z：284［M］＋， 185 ［ （CH2）10COOH］、 129［（CH2）6COOH］、73［（CH2）2COOH］ 呈现饱和脂肪酸的特征裂解，碎片离子峰在257 之后均相差1 个14（CH2） 质量单位，为直碳链的特征裂解方式。1H-NMR（Pyr-d5，500 MHz） δ：0.86（3H，t，J ＝5 Hz， H-18），1.28 （28H， br，-CH2），1.78（2H， m， H-3），2.52 （2H， t， J ＝7.5 Hz， H-2）；13C-NMR（Pyr-d5，125 MHz） δ： 176.0 （C-1），14.3（C-18），22.9 ～34.9（C-17 ～2）。以上数据与文献［9］ 基本一致，故鉴定为硬脂酸。

化 合 物7： 无 色 油 状 物， EI-MS m／z： 282［M］＋。1H-NMR（Pyr-d5，500 MHz）δ：5.43 ～5.46（4H，m，H-9、10、12、13），2.54（2H，m，H-11）， 2.48 （2H， t， J ＝6.0 Hz， H-2）， 2.07（2H， m， H-14）， 2.06 （2H， m， H-8）， 1.74（2H， m， H-3），0.85 （3H， t， J ＝5.9 Hz， H-18）， 1.25 ～1.384 （14H， m， CH2）；13C-NMR（Pyr-d5，125 MHz） δ：176.2 （C-1），34.9 （C-2）， 25.7 （C-3）， 29.5 （C-4）， 29.5 （C-5），29.7（C-6）， 29.4 （C-7）， 25.7 （C-8）， 130.2（C-9），135.3（C-10），25.6（C-11），135.5（C-12）， 123.8 （C-13）， 27.6 （C-14）， 32.2 （C-15），32.1（C-16），30.1（C-17），14.3（C-18）。以上数据与文献 ［10］ 基本一致，故鉴定为亚油酸。

化合物8： 无色针状结晶， EI-MS m／z：428［M］＋，397（100），基峰与离子分子峰相差1 个O2符合麦角醇的裂解规律。1H-NMR（Pyr-d5，500 MHz）δ：5.16 （1H， dd， J ＝13.2，6.5 Hz， H-23），5.19（1H，dd，J ＝13.1，5.9 Hz，H-22），6.52（1H，d，J ＝13.5 Hz，H-7），6.31（1H，d，J ＝8.5 Hz， H-6）， 4.31 （1H， m， H-3）， 1.09（3H，s，H-19），0.96（3H，d，J ＝15.0 Hz，H-21）， 0.90 （3H， d， J ＝3.8 Hz， H-28）， 0.85（3H，d，J ＝3.8 Hz，H-27），0.82（3H，d，J ＝3.8 Hz，H-26），0.81 （3H， s， H-18）；13C-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：35.5（C-1），31.3（C-2），65.9（C-3）， 37.5 （C-4）， 82.3 （C-5）， 135.4（C-6），131.0（C-7），79.3（C-8），52.0（C-9），37.5（C-10），23.7（C-11），39.6（C-12），44.7（C-13），52.0（C-14），20.2 （C-15），29.1 （C-16），56.3（C-17），13.0（C-18），19.9（C-19），39.6 （C-20）， 21.1 （C-21）， 135.4 （C-22），132.3 （C-23）， 43.1 （C-24）， 33.3 （C-25），20.2（C-26），18.4（C-27），17.9（C-28）。以上数据与文献［11］ 基本一致，故鉴定为5α，8α-环二氧-（22E，24R） -麦角甾-6，22-二烯-3β-醇。

化合物9： 白色片状结晶， EI-MS m／z：154［M］＋。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.28（1H，d，J ＝3.1 Hz，H-4），6.76（1H，d，J ＝3.2 Hz，H-2），6.61（1H，d，J ＝8.6 Hz，H-6）；13C-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：120.3（C-1），117.4（C-2），149.8（C-3），155.6（C-4），117.0 （C-5），121.3（C-6）。以上数据与文献［12］ 报道基本一致，故鉴定为原儿茶酸。

化合物10：无色针状结晶，EI-MS m／z：223［M］＋。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.60（1H，s， H-7）， 6.59 （1H， s， H-4）， 4.49 （1H， q，J ＝6.9 Hz，H-1），3.93（1H，dd，J ＝11.1，5.7 Hz，H-2），3.21 （1H， dd， J ＝16.9，11.5 Hz，H-3），2.97（1H，dd，J ＝10.7，16.8 Hz，H-3），1.59 （3H， d， J ＝ 6.9 Hz， H-10）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz） δ：53.3 （C-1），51.8 （C-2），30.1 （C-3），123.3 （C-4），146.6（C-5），146.0 （C-6）， 125.7 （C-7）， 115.9 （C-8），113.7（C-9），20.4 （C-10），173.6 （C-11）。以上数据与文献［13］ 基本一致，故鉴定6，7-dihydroxy-1-methyl-1，2，3，4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboylic acid。

化合物11：无色针状结晶，EI-MS m／z：299［M］＋。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：3.03（2H，d，J ＝7.5 Hz， H-3），3.12 （1H， d， J ＝711.3 Hz，H-12），3.87 （1H， d， J ＝16.8 Hz， H-2），4.55（1H，m，H-1），6.23（1H，s，H-5），6.55（1H，s，H-8），7.37（2H，s，H-13、13′），7.38（2H， s， H-14、14′），2.03 （1H， s， NH）；13CNMR（CD3OD，125 MHz） δ：58.4（C-1），49.5（C-2），30.8 （C-3），125.2 （C-4），113.6（C-5），145.8（C-6），146.5（C-7），116.2 （C-8），125.2 （C-9）， 41.2 （C-10）， 172.9 （C-11），145.8（C-12）， 128.5 （C-13）， 130.1 （C-14），125.2（C-15）。以上数据与文献［14］ 基本一致，故鉴定为6，7-dihydroxy-1-benzyl-1，2，3，4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboylic acid。

化合物12：无色针状结晶，EI-MS m／z：165［M］＋。1H-NMR（CD3OD，500 MHz） δ：7.25（2H，d，J ＝7.0 Hz，H-2′、6′），7.35（2H，m，H-3′、5′），7.30 （1H， d， J ＝6.7 Hz， H-4′）， 3.78（1H， dd， J ＝9.0，4.7 Hz， H-2），3.29 （1H，dd，J ＝2.2，4.9 Hz，H-3a），3.01（1H，dd，J ＝14.6，5.6 Hz， H-3b）；13C-NMR （CD3OD， 125 MHz）δ：173.7 （C-1），57.6 （C-2），38.2 （C-3）， 137.3 （C-1′）， 130.4 （C-2′、 6′）， 129.2（C-3′、 5′）， 128.4 （C-4′）。 以 上 数 据 与 文 献［15］ 基本一致，故鉴定为苯丙氨酸。

4 相关物质检测

参照《欧洲药典》 方法［2］，将化合物1～12 和左旋多巴原料药溶液分别注入高效液相色谱仪，未见有相同时间的出峰。

分别制订所有化合物TLC 展开条件，然后取化合物和左旋多巴原料药产品分别点样，在该化合物的展开系统中展开，未出现相同位置的斑点。

5 讨论

猫豆主要含有左旋多巴、猫豆胍等成分［16-17］，但因左旋多巴有显著的抗帕金森综合症活性，因此与猫豆相关的研究，大多与左旋多巴相关。以猫豆为原料生产左旋多巴的工艺中没有化学合成工序，不会产生新化合物，课题组从精制母液中分离得到的12 个化合物，溯其根源，也是猫豆的化学成分。

采用HPLC 和TLC 方法进行检测，均未在左旋多巴产品中检出12 个化合物，表明这些化合物不残留于左旋多巴原料药产品中，即应与左旋多巴原料药的相关物质无关。